Elisa原理及应用.ppt

内容 一.Elisa的发展 二.ELISA的定义 三.ELISA的原理 四.ELISA的基本方法 五.ELISA的应用 六.ELISA类别 七.ELISA的特点 八.ELISA实验中使用的仪器 一.Elisa的发展 二.ELISA的定义 三.ELISA的原理 四.ELISA的基本方法 四.ELISA的基本方法 五.ELISA的应用 六. ELISA类别 双抗体夹心法 间接法 竞争法 七.ELISA的特点： 八.ELISA实验中使用的仪器 * L/O/G/O 酶联免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 免疫标记技术 免疫荧光技术（IFA） 放射免疫测定法（RIA） 免疫酶测定法（EIA） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶免疫组化法 是一类常用的免疫酶技术，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，用酶标记抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相表面进行，检测液体中未知抗体或抗原的方法。 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 在ELISA方法中有三个必要的试剂： 固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent） 酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate） 酶反应的底物（显色剂） 360,450420 荧光黄色 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) β-Ｄ－半乳糖苷酶 405 420 黄色深蓝色 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 葡萄糖氧化酶 400500 黄色红色 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 碱性磷酸酯酶 492 460 449425642 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 辣根过氧化物酶 测定波长 显色反应 底 物 酶 基本实验流程： 微孔板 包被抗体 加样品(抗原) 孵育洗涤 加酶联二抗(辣根过氧化物酶) 孵育洗涤 孵育 加终止液(硫酸溶液) 加底物(邻苯二胺)显色 比色 包被抗体的酶 标反应板 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去未结 合的其他物质 加酶标抗体生成 抗体-待测抗原-酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤未结 合的酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行抗原的 定性或定量测定 ELISA法在生物医学各领域的应用范围概括为四个方面： 免疫酶染色各种细胞内成份的定位 研究抗酶抗体的合成 显现微量的免疫沉淀反应 定量检测体液中抗原或抗体成份 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，主要类型有： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 亲和素-生物素-ELISA法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。 当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。 灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。由于酶的催化效率很高，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 特异性高：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性 准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等