实验三：E玫瑰花环形成实验.ppt

实验三 E玫瑰花环形成实验 实验目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态 实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。 实验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子（又称淋巴细胞功能相关抗原2）即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。 应用最广的有总E花环试验(Et，t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea，a为active 的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数，Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数，这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。 实验步骤 1.取2ml人肝素抗凝血于试管中，加等量Hank’s液稀释，手动轻轻摇匀； 2. 用吸管吸取稀释抗凝血，缓慢加入淋巴细胞分层液上，注意保持两种液体界面清晰； 3.室温下2000rpm， 离心20min，离心后分为4层。 4.用吸管吸取血浆与分层液界面处单个核细胞层，移入另一干净试管； 实验步骤 5.加入5倍体积的Hank’s液吹打混匀，1000rpm离心5min，弃上清，用少量回流液重悬沉淀细胞，制成淋巴细胞悬液。 6. 取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1％绵羊红细胞悬液混匀，1000rpm离心5min，取出。 7.缓慢旋转试管底部，轻轻摇匀，吸取少许滴于载玻片上，加盖玻片，镜下观察。（Ea） 实验结果 * * E玫瑰花环实验→判断细胞免疫功能 T B T T淋巴细胞玫瑰花结电镜照片 T淋巴细胞玫瑰 花结示意图 20℃ , 1500rpm, 15min PBMC 红细胞粒细胞 Ficoll 稀释外周血 Ficoll 稀释的血浆、血小板 人静脉取血 四个同学一组； 严格无菌操作； 右手持注射器刺入静脉，徐徐抽取血液，达所需量时，拔出针头，用无菌棉球压迫止血。静脉血立即注入肝素管中。