超速区带转头的二次病毒纯化.PDFVIP

Marketing  天美（中国）科学仪器有限公司 TECHCOMP (CHINA) LTD. 中国北京朝阳区天畅园7 号楼1、3层 TEL:010 FAX:010 E-MAIL:techcomp@   超速区带转头的二次病毒纯化   设备：日立CP-70MX或CP-70ME超速离心机 P35ZT区带转头，RPZ-S密封加样器，Master-flex软管泵（流量100—1000ml/分） 样品：用鸡胚培养后收集的尿囊液，予冷至4℃左右（流感病毒，仙台病毒或其他）   予处理：  1. 已培养好的鸡胚（蛋）用75％酒精消毒； 2. 人工或机械（自动）收集鸡胚尿囊液，按鸡蛋大小收集量略有不同（每只6-8ml）； 3. 初滤：10μm滤芯过滤； 4. 连续流离心或超滤系统过滤； A. 连续流离心：日立R13C连续流转头，12,000rpm，流速600－800ml/分，上清液用于透 析浓缩 B. Millipore超滤系统：0.45μm滤膜 5. 透析浓缩：用Millipore超滤器，1000KD膜包。 浓缩后通常为尿囊液的1/30－1/40 浓缩后液体用于超速离心分离纯化。    区带转头离心分离：  第一组分离：  Marketing  天美（中国）科学仪器有限公司 TECHCOMP (CHINA) LTD. 中国北京朝阳区天畅园7 号楼1、3层 TEL:010 FAX:010 E-MAIL:techcomp@ Ⅰ.转头低速旋转：2000rpm—3000rpm，4℃，予冷（转头也可以在冰箱中予冷过夜） Ⅱ.从转头外壁依次注入：65mlPBS（磷酸缓冲液），1000ml予处理后的尿囊液（予冷4℃），130ml 30％（w/w）蔗糖液，然后用55％（w/w）蔗糖液充满转头（约450ml—500ml）（蔗糖液配置后 放在4℃冰箱中予冷待用） Ⅲ.拆除加样头，装上密封盖 Ⅳ.关闭离心盖板，抽真空，转头加速到32,000rpm（100,000xg）,4℃，150分钟 Ⅴ.超速离心完成后转速下降至（2000—3000）rpm，中心孔管道接到分光光度计的标准流动池。 流动池出口接分部收集器。 Ⅵ.用60％（w/w）的蔗糖从转头外侧泵入区带转头，从中心孔依次排出第一次离心后的各个组份 Ⅶ.排出的液体直接输入到分光计或蛋白核酸分析仪的标准流动池并连续测定O.D.值，测定后收集。 Ⅶ.病毒沉降在30％与55％蔗糖梯度之间的某个界面附近，分光计用280nm波长检测O.D.值，在 分光光度计的显示屏上或打印机上绘出转头的容量—O.D.值曲线。在高、低密度蔗糖梯度液之间有 一个病毒峰。30％--55％蔗糖在离心后由于浓度扩散在原界面附近已形成了一个连续的密度梯度。 【可以在分部收集后（约50管）用阿贝折射仪（4℃恒温）测定每管的光折射率并对照查出4℃时 的蔗糖密度，绘出蔗糖密度曲线】，而O.D.曲线峰顶的位置对应着某个蔗糖的密度。 Ⅷ.根据峰的位置认定病毒所在离心管 Ⅸ.留取约150ml病毒液4—5℃储存待用 Ⅹ.重复（Ⅰ—Ⅷ）的过程再做二次病毒的分离和收集，三次离心共收集粗制病毒液500--550ml， 4℃--5℃保存待用 第二组离心：  Ⅰ.将第一组三次离心后收集的粗制病毒液配置成20％（或25％）低密度蔗糖液（w/w） Marketing  天美（中国）科学仪器有限公司 TECHCOMP (CHINA) LTD. 中国北京朝阳区天畅园7 号楼1、3层 TEL:010 FAX:010 E-MAIL:techcomp@ Ⅱ.第一组离心后的区带转头停转后倒出浓（60％w/w）蔗糖（可以重复使用），清洁后，再安装到 离心机上低速旋转（4℃