表阿霉素和阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡论文.docVIP

　　表阿霉素和阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡论文 .freelol L-1 表阿霉素和阿霉素分别作用于人肝癌细胞株HCC-9204细胞3h.freelan hepatic cancer cells Abstract:AIM To provide the possibility for choice of drugs in clinical therapy of hepatic cancer，an hepatic cancer cell strain ol L-1 ）and doxorubicin（20μmol L-1 ）for3h respec-tively.Then the medium orphology，DNA elec-trophoresis and floetry.RESULTS MTT assay indi-cated a significant difference betental groups and the blank control group.The percentage of apoptotic cell etry identified peaks typical of apoptosis.Cells in G1 ，G2 and S phase of cell cycle -etry and the morphological obscervation. 0 引言 细胞凋亡（apoptosis），是受基因调控、细胞主动参与其自身有一定程序的生理性死亡过程，又称为程序性细胞死亡或细胞自杀［1］ .已知许多化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡达到清除肿瘤的目的［2，3］ ，表阿霉素和阿霉素是治疗肝癌的常用药物，为比较表阿霉素和阿霉素对肝癌细胞凋亡的诱导作用，我们应用表阿霉素和阿霉素对培养的人肝癌细胞株进行诱导其发生凋亡的研究，探讨表阿霉素和阿霉素对肝癌细胞诱导凋亡的机制，为临床治疗肝癌的药物选择提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 表阿霉素由法码西亚-普强公司提供;阿霉素购于深圳万乐公司;MTT，RNase A和蛋白酶K购于Sigma公司;PCD-AKP标记盒购于Boehringer Mannheim公司;人肝癌细胞株HCC-9204由本校基础部病理学教研室提供. 1.2 方法 将培养的HCC-9204肝癌细胞制成单细胞悬液，以每孔104 个细胞接种于进口96孔培养板中，每孔体积200μL，CO2 孵箱中培养2～3d，倒置显微镜下观察，待每孔细胞生长至对数生长期时，4℃放置1h，分别加不同浓度的表阿霉素和阿霉素.每6孔为一组，浓度相同.实验组分别为表阿霉素组和阿霉素组，剂量分为40，20，10和5μmol L-1 .对照组为未加药物的空白对照.实验组加药培养3h，移去药液，洗净药液后换培养液继续培养6h，每孔加新鲜配制的MTT（5g L-1 ）20μL作用4h，出现蓝色结晶，加二甲基亚砜150μL，振荡10min.比色用酶联免疫检测仪于490nm波长测定吸光度值，每组6个孔取均值，计算标准差，用方差分析进行统计学处理，比较各组间是否相差显著.待HCC-9204肝癌细胞生长至对数生长期，放置4℃1h，使细胞生长同步化，根据上述MTT试验结果，分别用4mL含20μmol L-1 表阿霉素、阿霉素的培养液作用3h，移去药液换培养液继续培养8h，倒置显微镜观察HCC-9204肝癌细胞约凋亡1/2～1/3，终止培养.收集已处理的培养瓶中细胞（1×107 ），酚-氯仿法提取DNA，用1.8g L-1 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察DNA电泳结果. 1.2.1 流式细胞仪检测 收集各组肝癌细胞，制备单细胞悬液，乙醇固定，4℃过夜，生理盐水洗涤，离心2次，100μL约1×106 个单细胞悬液中加碘化丙啶染色液300μL作用15min，EPICS ProfileⅡ型流式细胞仪检测，观察各组是否存在凋亡细胞并测定其含量、各细胞周期所占百分比，设未处理的肝癌细胞为空白对照. 1.2.2 TUNEL检测细胞凋亡 培养的HCC-9204肝癌细胞盖玻片，观察细胞生长至对数生长期时，4℃放置1h同步化，药物处理3h，洗去药液换培养液继续培养8h，用40g L-1 PFA（pH7.4）室温固定30min，0.01mol L-1 PBS洗3次，每次5min，用1g L-1 Triton X-100，1g L-1 枸橼酸钠在冰上处理2min，加50μL TUNEL反应液，上覆parafilm，暗处湿盒中37℃孵育1h，0.01mol L-1 PBS洗3次，每次5min，荧光显微镜观察，摄像. 1.2.3 激光共聚焦显微镜检测 将TUNEL法标记标本用488nm激发F