免疫组化原理与流程介绍.ppt

免疫组化的原理及流程介绍;主要内容;免疫组化原理及流程介绍;80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;三 免疫组化的基本流程;免疫组化原理及流程介绍;;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。 ;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍; 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 ; 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。 ;免疫组化原理及流程介绍; 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 ; 1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min ;; ;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双???水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 3) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 4) 封片：中性树胶。 ;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍; 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。 ;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍; 2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;免疫组化原理及流程介绍;1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。 2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止干片 。;3.以下原因可能导致片子着色不均匀： ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜的 二甲苯中； ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。;4.一抗的清洗：;5.PBS的PH和离子强度的使用。;5.拍照;免疫组化原理及流程介绍