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重庆医科大学内部使用教材 生物化学与分子生物学实验 重庆医科大学 2008年1月 重庆 目 录 第一章 生物化学部分 1 实验一、双缩脲法测定血清蛋白质含量 1 实验二、纸层析法观察转氨基作用 2 实验三、血清醋酸纤维薄膜电泳 4 实验四、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 7 实验五、胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素 10 实验六、酶的竞争性抑制作用 13 实验七、血糖浓度的测定 16 实验八、血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 18 第二章 分子生物学部分 25 实验一、质粒DNA的提取制备与检测 25 实验二、PCR技术 28 实验三、DNA的限制性酶切与电泳 31 实验四、DNA连接实验 38 实验五、重组DNA转化与篮白斑筛选 41 实验六、SDS测定蛋白质的相对分子量 44 第一章 生物化学部分 实验一、双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验目的】 1．掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。 2．学习掌握分光光度计的使用。 【(-CONH-)的化合物，在碱性溶液中能与硫酸铜中Cu2+反应生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应，且在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含量。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一，该方法的优点是操作简便、迅速、受蛋白质性质的影响较小。在体液中小分子多肽含量极少，除蛋白质外几乎不存在能与双缩脲试剂显色的物质。各种血浆蛋白质，包括正常和病理的，呈色程度基本相同，因此双缩脲法是测定血浆蛋白较简便的方法。但本方法灵敏度较差，需要样本含蛋白质1~20mg水平才能检测到；而且特异性不高，除含-CONH-的化合物有此反应外，凡是含-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团的化合物也有此反应。 【实验材料与仪器】 1 （1）721型分光光度计。 （2）玻璃仪器：试管13支；l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支（或移液器一个）。 （3）坐标纸。 2．试剂 （1）6 mol NaOH：称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。 （2）双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O 2.5g，酒石酸钾10.0 g和碘化钾5.0 g，分别溶解后混匀，加5 mol NaOH l00 ml，最后加水至1000 ml，贮于棕色瓶中，避光保存（有暗红色沉淀不能使用）。 （3）9 g/L NaCl溶液。 （4）蛋白质标准液(10 mg/m1)：称取干燥牛血清蛋白100.0 mg，以少量9 g/L NaCl溶液溶解后倒入l0 ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后用9 g/L NaCl溶液加至刻度。或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0 mg/m1作为蛋白质标准液。 （5）待测血清样本：将人血清、或动物血清用9 g/L NaCl溶液稀释10倍，即可用于测定。 【】1．取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它各号测定管均重复做两管），按下表操作并记录：表 双缩脲法测定血清蛋白质含量 管号 试剂(ml) 空白管 标准管 测定管×2 1×2 2×2 3×2 4×2 5×2 蛋白质标准液 （1ml=10mg） — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 待测血清样本 — — — — — — 1.0 9g/L NaCl溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 — — 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 光吸收值 (λ=540nm) 0分钟。以空白管调零，在波长540nm比色，读取各管光吸收值，并记录。 2．在座标纸上以 3．以测定管的吸收值在标准曲线中查出该待测血清样本的蛋白质浓度（gL）（gL）【】1．用双缩脲法和分光光度法的基本原理解释为什么双缩脲法可以定量测定蛋白质的含量。 2．为什么标准曲线法与计算法测定的蛋白质数值有差异？分析两种方法产生差异的可能原因。 3．本实验应于加双缩脲试剂多少时间才能进行比色测定？并应在显色多少时间内完成比色读数，为什么？ 【实验目的】 1．学习氨基酸纸层析的基本原理 2．掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应。在转氨酶的催化下，氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基的互换反应称为转氨基作用。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化，转氨酶广泛分布于机体各组织、器官。 本实验用纸层析法观察α-酮戊二酸与丙酮酸在肝脏谷丙转氨酶（ALT）催化下的转氨基作用（图2-1）。 α-酮戊二酸 丙氨酸 谷氨酸 丙酮酸 图-1 ALT催化的转氨基反应 实验组发生转氨基反应，在最后的体系中存在