基于结构开关的适体生物传感器检测艰难梭菌毒素 - 第三军医大学学报.doc

基于SELEX技术筛选艰难梭菌毒素A的适体生物传感器研究 刘怡1, 胡莉娜2(401331重庆，重庆医药高等专科学校 1 ；6100832四川 成都，成都军区总医院2 ) [摘要]目的 研制一种灵敏检测艰难梭菌毒素A（Toxin A, TOA）的适体生物传感器。 利用金纳米颗粒(Gold nanoparticles, GNPs)将指数富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选的TOA适体固定在Nafion-Thionine修饰的丝网印刷电极上，并基于所筛选适体与艰难梭菌毒素A（Toxin A, TOA）的特异性结合，构建新型的结构开关型电化学生物传感器。 该生物传感器性能稳定、灵敏度高、特异性强，TOA在0-200ng/ml范围内与传感器的电流强度呈良好的线性关系，检测限为1 ng/ml。TP212.3 [文献标识码] A 艰难梭菌相关性疾病发生的条件是抗生素破坏了肠内菌群平衡，肠道有益菌减少，艰难梭菌大量繁殖，并产生A、B两种毒素，这两种毒素会引起严重的腹泻和肠道炎症[1-2]。由于艰难梭菌毒素对易感个体作用极快，因此在病人粪便标本中早期检出病原菌或者是毒素A和B成了诊断和确认其感染的唯一方法。目前，临床上常用的培养加形态学诊断方法存在敏感性低、耗时久的缺陷[3]。标本中游离的DNA数量有限，使得基于DNA检测的分子生物学方法阳性检出率低，同时标本的预处理繁琐，影响检测结果的准确性[4]。采用ELISA检测艰难梭菌毒素虽然具有微量、高效、方便等特点，但由于在许多实验中所用的抗毒素除含有针对A、B毒素的抗体外，也含有其它的抗体成分，会导致假阳性结果存在[5]。因此，构建一种能灵敏、快速地检测艰难梭菌的方法对诊断抗生素相关性腹泻显得十分重要。 　 在本研究中，我们提出以艰难梭菌毒素为靶标，用SELEX技术筛选艰难梭菌TOA的特异性适体[6]，根据所筛选适体的结构特点，制备电化学生物传感器[7]，并用于TOA的检测，这将会对临床上诊断艰难梭菌感染提出一个新的思路。 随机ssDNA库： 5’-TAGTGATGCCTTTGTTGAGA-[N40]-TCTTCATCGTCCACTAAATT-3’； 引物1： 5’-TAGTGATGCCTTTGTTGAGA-3’； 引物2： 5’-Biotin-AATTTAGTGGACGATGAAGA-3’； 捕获探针（Capture probe, CP）： 5’-HS-(CH2)6-GTCCTCACGACCCTGCCC-3’； 适体探针（Aptamer probe, AP）： 5’-HRP-AGACTTGGGGGCAGGGTCGTGAGGAC-3’； TOA、Nafion、硫堇（Thionine, Thi）、磁珠、氯金酸、巯基乙醇（MCH）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）均购于Sigma-Aldrich，碳墨、银墨、UV胶购于TaiTungHong。艰难梭菌由重庆医药高等专科学校医学技术学院微生物教研室提供，所有试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。 CHI 660D型电化学工作站（中国上海辰华），FACS -Aria流式细胞仪（美国BD）、TC-E-96CG型PCR仪（中国杭州博日）、Sunrise酶标仪（瑞士Tecan）、YKP-2800×1400型丝网印刷仪（中国广东顺德胜江）。 　 将羧基化磁珠与TOA于室温下在摇床上孵化12h，未结合磁珠的TOA用磁铁分离，结合磁珠的TOA又悬浮于100μl PBS(10 mmol/L phosphate, 138 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, pH 7.4)中. 再将500pmol的随机ssDNA加入结合缓冲液(100μL, 10 mmol/L phosphate, 138 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.05% Tween, pH7.4)，于95 ℃变性5 min后置于冰水中冷却10 min。然后将随机ssDNA文库与阴性磁珠(没有结合TOA的磁珠)进行反筛选以除去非特异性结合的磁珠。未结合磁珠的DNA序列与阳性磁珠(结合TOA的磁珠)在37 ℃孵化60 min，接着除去未结合或非特异性结合的寡核苷酸。用生物素标记引物对结合有阳性磁珠的序列进行PCR扩增形成dsDNA，接着再将dsDNA用NaOH解链，将链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的反义单链DNA结合，未结合到磁珠上的就是筛