第八章 miRNeasy Serum Plasma血清血浆中纯化miRNA.pdfVIP

Sample Assay Technologies miRNeasy Serum/Plasma - Chinese protocol血清血浆中纯化miRNA 2012年05月 胡川 Sample Assay Technologies 1、血清和血浆的收集、 ，分离以及储存 、、 为了从全血中分离游离核酸，我们推荐一下操作步骤，包括首先用低转速离 心步骤将血清血浆中的细胞分离出去，接着用高转速离心步骤将残留的细胞 来源碎片去除。后面的离心步骤将会极大地降低样本中细胞来源的基因组 DNA和RNA的量。细胞内大量的高丰度RNA，以及少量的细胞来源碎片都 有可能对无细胞体液中RNA表达发生重要影响。因此，对于其他无细胞体液， 例如尿液，也推荐用同样的操作步骤去除细胞来源碎片。 miRNeasy Serum/Plasma - Chinese protocol血清血浆中纯化miRNA 2 Sample Assay Technologies 血浆分离和保存 A1 、使用BD的Vacutainer® Venous Blood Collection Tubes (cat. no. 367525，含 有EDTA)，或者其他用EDTA作为抗凝剂的血液收集管来收集全血。将管子在室温 (15–25°C) 或者4°C 下1小时内操作。 注意注意：不要用含有： heparin 的血液收集管，因为这种抗凝剂会干扰后续分析，例如 注意注意：： RT- PCR A2 、将收集管里的血液样本在1900 x g (3000 rpm) 下4°C 离心10 min （吊篮式转 子）。 A3 、小心将上清 （黄色）转移至一个新的收集管 （圆底），不要碰到淡黄色的血小 板层 （包含白细胞和血小板层）。通常10 ml全血可以获得4-5 ml血浆。 注意注意：淡黄色分层是血浆中细胞来源的： miRNA/RNA污染最有可能存在的地方。 注意注意：： 注意注意：这个时期的血浆可以用来纯化游离核酸： 。但是下面高速离心的步骤将会去除 注意注意：： 细胞来源的碎片，并将破碎血细胞释放的基因组DNA和RNA来源的游离核酸污染最 小化。 miRNeasy Serum/Plasma - Chinese protocol血清血浆中纯化miRNA 3 Sample Assay Technologies 血浆分离和保存 A4 、将装有血浆样本的圆底管在16,000 x g 下4°C 离心10 min （固定角度转子）。 这一步将去除细胞来源碎片以及伴随其而来的核酸。 A5 、小心将上清移至一个新的管子，不要碰到沉淀 （在管底壁一侧） A6 、如果当天会继续核酸纯化步骤，则将样本储存在2–8°C 。如果长期保存，则在 –80°C 下冻存。 A7 、在使用冻存的血浆之前做核酸纯化之前，将其在室温下(15–25°C) 下溶解。 可选操作：移除冷凝蛋白质，将溶解好的血浆样本在16,000 x g 下4°C 离心5 min （固定角度转子）。将上清转到一个新的管子，开始核酸纯化步骤。 miRNeasy Serum/Plasma - Chinese protocol血清血浆中纯化miRNA 4 Sample Assay Technologies 血清分离和储存 A1 、使用Sarstedt S-Monovette® Serum-Gel 9 ml tubes (cat. no. 02.1388，含有凝 血剂)，或者其他不含有凝血剂和抗凝剂 （EDTA或者柠檬酸盐）的血液收集管来收 集全血。为了完全凝固，将管子在室温(15–25°C) 下放置10 min至 1 h。 注意注意：含有凝血剂的管子在放置： 10 min后开始下一步操作，不含凝血剂的管子须在 注意注意：： 室温下放置至少30 min让样本凝血充分。 A2 、1900 x g (3000 rpm) 下4°C 离心10 min （吊篮转子）。 注意注意：如果使用： Sarstedt S-Monovette® Serum-Gel 9 ml tubes，一层凝胶床将会在 注意注意：