第18章高效液相色谱法分析化学课件.ppt

二、定量分析方法 液相色谱法的定量方法与气相色谱法相同，常用外标法及内标对比法等进行定量分析。 1．外标法 以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量的方法称为外标法。 可分为外标工作曲线法、外标一点法及外标二点法等。 2．内标法 分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法及校正因子法等，在HPLC中最常用内标对比法。 1、相对分子量 ①分子量＞2000，凝胶色谱柱 ②分子量2000，但同时分子量相差＞10%， 凝胶色谱柱 ③分子量＜2000的水溶性电解质，酸性物质用 阴离子交换树脂，碱性物质用阳离子交换树脂 三 高效液相色谱分离分析方法的选择 ④分子量＜2000的水溶性非电解质，选用反相 色谱法 ⑤分子量＜2000的非水溶性物质，弱极性物质 选用反相色谱法，极性物质选用正相色谱法。 2、溶解度 水溶性样品 离子交换色谱或液-液分配色谱 微溶于水，但在酸或 碱存在下能很好离心 的化合物 离子交换色谱 油性样品 液-固色谱法 相对非极性化合物 液-固色谱法 3、化学结构 结构特点 分离方法 离子型化合物 离子交换色谱，空间排阻和液-液分配色谱 异构体 液-固色谱法 同系物 液-液分配色谱 高分子聚合物 空间排阻色谱法 极性增加 不溶于水 溶于水 非极性 离子 非离子极性 吸附 反向分配 分配 正向分配 离子交换 尺寸排阻 凝胶渗透 凝胶过滤 分 子 量 输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25～100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。 4.梯度淋洗装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。 如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2. 高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。 （二） 色谱柱 由柱管与固定相组成，柱管多用不锈钢制成，管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀浆法高压（80 ～ 100MPa）装柱。 色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类 分析型柱 常量柱：内径2～4.6mm，柱长10～ 25cm。 半微量柱：内径1～ 1.5mm，柱长10～ 20cm 实验室制备型柱：内径20～ 40mm，柱长10～30cm 色谱柱柱效的评价 柱性能指标包括在一定条件下（试样、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度H和理论塔板数n、对称因子f、容量因子k和选择性因子的重复性α或分离度R。 分析样品时，需检验柱性能是否合乎要求。 常用色谱柱柱效评价条件如下： 硅胶柱 样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）； 流动相：无水己烷。 反相色谱柱 （ODS柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）； 流动相：甲醇——水（85：15） 乙腈——水（60：4O）。 正相色谱柱（氰基与氨基柱等） 样品： 四氯乙烯（测死时间用）、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇。也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯为样品； 流动相：正庚烷 按上述条件，测得各组分的W1/2。及tR，求出理论塔板数n及相邻组分的分离度R（＞l·5）。 色谱柱柱效指标 填料粒径为3μm、4μm、5μm 、7μm或10μm时，柱效应分别大于8万、6万、5万、4万及 2．5万理论塔板数／米（或用 m－1表示）。 色谱柱的再生 反相色谱柱 以甲醇一水（95：5）、纯甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应20倍于柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。 正相色谱柱（含硅胶柱）以严格脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步骤同上