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研習報告與討論期末報告 Point mutation of ZDBS and Z40A protein to find the important nucleotides of Z40A (zinc finger protein) DNA binding sites and the important fingers of Z40A DNA binding domain. ZDBS(Z40A DNA binding sites) Lab：中研院生醫所R206賴建勳 老師 Student：生科05 901638 林珮婷 2004.01.15 Introduction Zinc finger protein(鋅指蛋白)是一種常見的transcription factor(轉錄因子)。在哺乳類動物中，鋅指蛋白佔transcription factor的大多數，與各種基因的調控和細胞發育有關。可在DNA進行transcription時，會間接或直接bind到DNA的enhancer，抑制或增加transcription。此種蛋白質主要的特徵是蛋白質的會形成像手指的protein domain， C2H2型鋅指(圖1)。利用這種手指形狀的結構bind到DNA major groove。通常會有multiple fingers以加強作用。同時，特定的protein biding domain sequence會和bind上的特定DNA binding sequence。 本實驗所使用protein：Z40A便是屬於zinc finger protein中的一種。主要有一個KRAB domain(transcription-activatoin domain)負責和一類的輔抑制因子作用，以及１２個zinc finger(DNA binding domain)負責bind到DNA。Z40A是一種repessor，對於dowmsteam DNA的transcription有「抑制」的作用。(圖2)同時發現，此種蛋白質的DNA binding sites和GATA family的作用序列有一些重疊的地方(圖3)。而且，表現在紅血球細胞中的GATA-1和T細胞中的GATA-3會和Z40A有競爭bind到DNA的能力，因此我們希望能夠對這個蛋白質更深入研究。 先前的實驗已經找出這一新型的鋅指蛋白的序列以及其和DNA作用的DNA序列。並且發現在Z40A binding domain的７到１２個fingers對於DNA的binding是比較重要的。因此，我們實驗主要分為兩部分來進行，第一，於找出這７到１２個fingers哪些對於bind到DNA上有重大的影響，第二，找出DNA binding sites(sequence)中的１２個nucleotides哪幾個是特別重要的。藉由這兩個實驗，更精確地知道蛋白質和DNA兩者互相作用的序列。 圖1?這是一個Zinc finger的 卡通圖，是由兩個cysteine(再和兩個histidine 接上一個鋅離子所形成的形成一個像手指的結構。特別注意的是，zinc figer在和DNA結合時並不像卡通圖示只有指尖部分bind到DNA的major groove，指側部分亦有可能和DNA結合。 N-terminal C-terminal 圖2?Z40A圖示 KRAB—C2H2 fingers ↑ ↑ bind輔抑制因子 bind DNA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 GATA-1 Z40A G G C G A T A A G T A A 圖3?這是gel shift的實驗結果。圖中點的面積表是binding的重要性。面積越大表示越重要。 Material Method 實驗一 DNA binding sequences—Point mutation 材料： transformation Z40A DNA site binding sequence (ZDBS) (insert) PGL3-SV40 (plasmid) E.coli--DH5α(其他的實驗室已經做過) (competent cell) Mammalian transfect