细胞产物分析技术-4色谱分离分析方法-2011.pptVIP

第四章 色谱分析技术 气相色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法 气相色谱法（gas chromatography，GC）,以气体作为流动相的色谱分析方法,这种气体被称为载气。一般可分为气液色谱法和气固色谱法两种。 气相色谱法 气/固色谱 主要用于分离常温下的气体和低沸点的有机物。试样由载气带入柱子后，立即被吸附剂所吸附。载气不断流过吸附剂时，被吸附的组分又被洗脱下来，这一过程被称为脱附。试样中各组分的性质不同，在吸附剂上的吸附能力有差别，较难被吸附的组分容易脱附，移动速度快，先流出色谱柱。组分经多次反复吸附、脱附而彼此分离，先后流出色谱柱。 气相色谱法 气/液色谱 气/液色谱应用更为广泛，实际工作中高达80％的样品使用气/液色谱。试样由载气带入柱子后，被固定液所溶解。载气不断流过时，被分离组分在固定液中溶解度不同，经反复分配达到分离。 气相色谱法 气相色谱法 （1）载气系统 （2）进样系统 （3）色谱柱和柱箱 （4）检测系统 （5）记录系统 气相色谱法 仪器组成 载气系统 包括气源、净化器、气体流量控制和测量等部件，载气在压力梯度的作用下在柱内运行，要求载气干燥纯净、流量稳定。 进样系统 包括进样器、汽化室，将试样引入色谱柱并使常温下为液体的试样在汽化室瞬间汽化。进样系统的出口由硅橡胶隔膜密封，样品通过注射器刺穿隔膜注入系统。填充柱的进样量一般为0.5～20μl。 气相色谱法 仪器组成 色谱柱和柱箱 包括温度控制装置，混合试样在此进行分离。短柱可以直线形或U形柱放入柱箱，较长柱则盘绕成螺旋状。柱子使用前必须在载气流中充分加热老化，以达到除去残余溶剂或活化硅胶或分子筛的作用。 检测系统 包括检测器、检测器的电源及控制装置，对柱后已被分离的组分进行鉴定与测量。 记录系统 包括放大器、记录仪和色谱数据处理系统，记录由检测器产生的信号，以便对试样进行定性、定量分析。 气相色谱法 常用术语 基线（baseline）：当色谱柱后没有组分进入检测器时，记录到的信号称为基线。它反映了检测器系统噪声随时间的变化。稳定的基线是一条水平直线。 保留时间（retention time）：从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值所需时间，以tR表示。 保留体积（retention volume）：从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时流动相所通过的体积，用VR表示。 气相色谱法 常用术语 相对保留值（relative retention value）。在相同条件下，组分 2与组分 1的调整保留值之比，用r21表示。只要柱温、固定相和流动相的性质保持不变，即使柱长、柱径、填充情况及流动相流速有所变化，其比值仍基本保持不变，所以它是色谱定性分析的重要参数。相邻两组分的tr’或VR’相差越大，两峰相距越远，分离程度越好，r21值也越大，当r2l=1时，两组分不能分离。r21也可以用来表示色谱柱固定相的选择性，因此r21也被称作选择因子。 气相色谱法 常用术语 死时间（dead time）：不被固定相滞留的组分（如空气、甲烷等）从进样开始到柱后出现浓度最大值所需时间，用tM表示。它表示不被固定相滞留的组分在柱内空隙中运行所耗费的时间，正比于色谱柱的空隙体积。 死体积（dead volume）：不被固定相滞留的组分，从进样开始到往后出现浓度最大值时所需流动相的体积，用VM表示。它表示色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间总和。 气相色谱法 常用术语 半峰宽(peak width at half-height) Y1／2。又称半宽度或区域宽度，即峰高为一半处的宽度。由于Y1/2易于测定，使用方便，常用它表示区域宽度。 峰底宽度(peak width at peak base)Y,自色谱峰两侧的拐点 所作切线在 基线上截距 间的距离。 气相色谱法 塔板理论(plate theory) 该理论把整个色谱柱比拟成精馏塔，把色谱分离过程比拟作精馏过程。色谱柱由长度为H的许多小段组成，犹如精馏塔由许多塔板所组成一样。 在每小段距离H内达成一次汽液平衡，相当于在精馏塔中一块塔板上完成一次分离，色谱柱的这一小段距离H称为理论塔板高度(height equivalent to theoretical plate)。 柱的分离效果用理论塔板数n (number of theoretical plates)表示。n值越大，表示达成汽液平衡的次数越多，分离发生的机会也越多，柱效越好。 气相色谱法 分离度R(resolution) 相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰底宽度之和的一半的比值。 分子是两组分峰间的距离，分母是色谱峰宽窄的度量，R值越大，相邻两组分分离得越好。分离度综合这两个因