细菌计数-生长筛选诱变-第三节.pptVIP

第二章 工业微生物基础 第三节 微生物菌种的分离选育和保藏 细菌生长（数量）测定方法 借助显微镜观察测定 1.涂片染色法 2.计数器(血球计数板）测定法 3.比例计数法 比例——样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例 4．比浊计数法 浊——细菌悬浮液的浊度 5、平板计数法 将待测样品制成菌悬液；菌悬液用10倍稀释法适当稀释；定量取稀释液（0.2ml）涂平板培养，根据平板上生长的菌落计数； 特点：活菌计数，适用于单细胞微生物； 要点：同一稀释度涂布三皿以上取平均值计数；每支移液管或枪头只能接触一个稀释度的菌液； 一、微生物菌种的分离 选育—筛选与定向培育 筛选—“众里挑一” (1) 采样 原理：微生物的生态特点 优胜劣汰 天然——特殊区域采样 例如 筛选能降解石油的细菌？ （2）增殖培养 给予有利的培养条件，如特殊的碳源、pH值、温度。 添加一些专性抑制剂，如在分离放线菌时，添加10%苯酚，以抑制霉菌和细菌的生长。 （3）纯种分离 划线法 稀释法 选择性培养基 ① 投毒法 常用物质为染料、胆汁酸盐、金属盐类、酸、碱和抗生素。 例如欲分离古细菌，培养基中通常加入青霉素（由于古细菌的细胞壁不同于普通细菌，因而不会被对破坏普通细菌细胞壁结构的青霉素杀死），古细菌就唯一分离并存活下来。 胆汁酸盐——抑制革兰氏阳性菌 提问：它能选择性生长那种细菌？ 革兰氏阴性细菌 ②投其所好法 好→→→营养、环境因子 （1）专一性营养源培养法 待选细菌专门需要的某种碳源或氮源 例如筛选纤维素分解菌选用纤维素作为培养基中的唯一碳源； 各类降解石化废水特殊有机物的细菌筛选通常是以这类有机物为培养基中的唯一碳源，将目的细菌富集筛选下来。 （2）理化因素控制法 理化因素——特殊的温度、氧气、pH、盐度等环境条件 主要用于筛选极端环境微生物。如嗜盐、嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱等的细菌，同时也被用于选择性培养好氧或厌氧细菌。 （1）渐变－诱导法(休眠的酶基因复活+自然突变) 方法： （2）突变—诱变法 提问：哪些因素可以引起基因突变呢？ A．基因突变的特点 发生Ⅰ.随机性结果Ⅱ.无定向性 基因突变在哪一个细菌中发生是随机的，突变基因的部位也是随机的。突变的发生没有固定的方向。 频率Ⅲ.稀有性 可Ⅳ.诱变性 突变率（每一细菌在每一世代中发生某一性状突变的机率）通常为10-5~10-10。十万至一百亿个细菌中才可能有一个细菌的基因发生突变。 人工诱变可提高10～105倍 Ⅵ.可逆性 修复成功 Ⅴ.稳定性 修复失败 产生的变异性状是稳定的、可遗传的。 利用基因突变的特点，可以通过人工诱变进行细菌的基因改造。 常用的诱变剂：紫外线、5—溴尿嘧啶、亚硝酸、卟啶染料等。 Ⅱ.选择合适的诱变剂剂量进行诱变 提问：为什么要有剂量限制呢？ 少,效率低;过高“是药三分毒” 会造成细菌大量死亡。 例如在进行细菌紫外诱变时，通常使用15或20W的紫外灯距离细菌单细菌悬浮液15~30cm，照射15~20min。 Ⅲ.筛选突变出的高效菌 提问：如何筛？ 选择性培养基:抑制不需要的性状：如抗性筛选、抗渗透压筛选；还需添加必需的营养，如缺陷型菌株的筛选。 综合评价 诱变法潜力要远大于诱导法，但操作复杂。在实际诱变中，往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体。最后这些突变体将会在实验室小试、中试的基础上被投放到生产实践中。 （3）基因重组法 不同个体基因重新组合 A．形式 自发基因重组与人工基因重组 自发基因重组 a. 真 核 生 物 为 杂 交； 精卵细胞质融合过程中所有遗传物质的重组 Ⅰ.转化Transformation （引进） 供体细菌研碎物中的DNA片段直接吸收进入活的受体细菌并发生基因重新组合的方式。 Ⅱ.接合 （合作） Ⅲ.转导（间谍窃取） 噬菌体－细菌病毒 通过噬菌体的携带而转移导入的基因重组现象称为转导。 转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。 B.人工基因重组—遗传工程 遗传工程是70年代初发展起来的生物技术。 定义：对遗传物质进行改造（人工干预下的杂交、转化、接合、转导）的技术。 工程：类似工程设计那样有很高的预见性、精确性与严密性。 遗传工程的方法 遗传工程方法包括两个水平的研究：一种是细胞水平；另一种是基因水平。所以，又可把它分为细胞工程和基因工程。 细胞工程——两个细胞原生质体融合 例如：降解石油的工程细菌 70年代美国生物学家查克捡巴蒂(Chakrabarty)针对海洋输油，造成浮油污染，影响海洋生态等问题进行了研究。石油成分复杂