第十一章 miRNeasy Mini Kit-人血中纯化miRNA.pdfVIP

Sample Assay Technologies miRNeasy Mini Kit - Chinese protocol血液中纯化血液中纯化miRNA 血液中纯化血液中纯化 2011年11月 胡川 Sample Assay Technologies 从人类血液中提取总从人类血液中提取总RNA和和miRNA 从人类血液中提取总从人类血液中提取总 和和 本操作流程需要额外订购本操作流程需要额外订购Buffer EL (cat. no. 79217) 本操作流程需要额外订购本操作流程需要额外订购 步骤步骤：： 步骤步骤：： D1、在一个适量大小的管子 （未提供）内，将一份人类的全血与五份Buffer EL混匀； 为了获得最佳的实验效果，血液和Buffer EL的总量不要超过管子总容量的3/4，以确 保可以将液体充分混匀。 注意注意：全血的量要适中： ，最多处理1.5 mL的正常血液 （一般每mL中有4000-7000 个 注意注意：： 白细胞）。如果白细胞的量较高，需要适量减少血液的量。 D2、冰上孵育10-15 min。在孵育的过程中，短暂涡旋混匀2次； 在孵育过程中，悬浮液会逐渐变为半透明状，这代表着红细胞正在裂解中。如有需要， 孵育时间可以延长至20 min 。 D3、4°C 下400 x g 离心10 min，移去上清； 白细胞在离心后的沉淀中。需确保上清都被去除。微量的红细胞在沉淀里残留，会在 后续的清洗步骤里去除。 miRNeasy Mini Kit -血液中纯化血液中纯化miRNA 2 血液中血液中纯化纯化 Sample Assay Technologies D4、在沉淀中加入Buffer EL （D1 步骤中血量的2 倍体积），短暂涡旋将白细胞重 新悬浮； 例如，在D1 步骤中加入的是1 mL 的血液，则加入2 mL 的Buffer EL。 D5、4°C 下400 x g 离心10 min，移去上清； 注意注意：去除上清不完全将会影响之后的裂解释放： RNA的步骤，以及之后柱子对RNA 注意注意：： 的结合，从而导致产量低。 D6、继续handbook第19页中的操作步骤 （Protocol: Purification of Total RNA, Including Small RNAs, from Animal Cells）的第二步。请见下一页PPT。 miRNeasy Mini Kit -血液中纯化血液中纯化miRNA 3 血液中血液中纯化纯化 Protocol: Purification of Total RNA, Including Small RNAs, Sample Assay Technologies from Animal Cells 2、在细胞悬浮液中加入QIAzol Lysis Reagent混匀； 如果细胞发生沉淀，可以轻拍管壁使细胞完全悬浮。加入700 µl QIAzol Lysis Reagent，涡旋或吸打混匀。 注意注意：细胞不完全悬浮会导致细胞裂解不充分并降低： RNA产量。 注意注意：： 6 3、处理的细胞在3 x 10 以下，则涡旋震荡1 min 使细胞匀质化； 注意注意：不完全匀质化会导致： RNA产量显著减少，并会导致RNeasy Mini spin column 注意注意：： 柱子堵塞；匀质化的细胞裂解液可以在–70°C