线虫的分类鉴定.ppt

近年来，越来越多的分子生物学技术应用到植物病原线虫学研究领域, 在植物线虫病害诊断、分类以及流行学调查方面得到广泛应用，下面详细介绍PCR、PCR-RFLP、RAPD、分子杂交等目前常用的分子技术。 （1）多聚酶链式反应（PCR） PCR技术基本原理：类似于DNA的天然复制过程， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使之成为单链； 模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 最后这种DNA片段能在普通琼脂糖凝胶上进行电泳。 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，它含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。溴化乙锭在标准302nm 紫外光透射仪激发下放射出橙红色信号，可用凝胶成像处理系统拍摄。 应用实例： （3）PCR-RFLP方法 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法的原理是：采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱分析此段序列的特异切位点，由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。 应用实例 （4）RAPD技术 随机扩增的多态性DNA，RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 应用实例 （5）SSR-PCR技术 由于真核生物中富含CA重复序列，SSR－PCR就是针对高度密集的CA微卫星体简单重复序列，设计与之互补的重复CA碱基作引物扩增其重复片段，从而揭示其多态性。 （6）分子杂交技术 核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。 它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。 植物线虫的其他鉴定方法 M.incognita M.javanica M.arenaria RAPD-PCR鉴定根结线虫 * * * 一、植物线虫分类的基本概念和内容 二、植物线虫的形态分类特征 三、植物线虫的分类地位和分类系统概述 四、常见植物线虫属的的鉴定特征和一般生 物学特性 第三节　植物病原线虫的分类 要求：了解植物病原线虫分类的基本概念和内容，掌握植物线虫的形态分类特征，分类地位和分类系统，了解常见植物线虫属的鉴定特征和鉴定方法。 一、植物线虫分类的基本概念和内容 植物线虫分类的目的和内容主要包括以下几个方面: (1) 鉴定：研究区分和确定植物线虫的各个种类，按照国际动物命名法规予以命名，并加以描述，提供正确识别和辨别线虫种类的知识和资料。 (2) 分类：根据线虫种类之间的异同及亲缘关系，确定其所属的分类 阶元层次，制定分类系统。 (3) 系统学：探寻线虫种类的起缘及其之间的亲缘关系，追溯其进化过程。 (4) 分类学：狭义的植物线虫分类学是研究植物线虫分类的方法和理论，广义的植物线虫分类学就是研究上述诸内容的一门科学。 植物线虫分类的基本概念和内容 植物线虫分类学：是运用比较、分析和归纳等方法，依据线虫表达系统发育关系的性状或性状组合，对植物线虫进行鉴定、命名和排序，制定可以反映植物线虫进化过程或阐明各类群内在关系的分类系统，进而揭示植物线虫的起源及各种群之间的亲缘关系，同时不断探索新的分类方法和理论。 植物线虫分类鉴定