冰冻切片实验步.docVIP

全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗？？？冰冻切片不能用热修复啊！！！以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育1~2小时或4过夜。3 PBS冲洗，5分钟×3次。4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育10~30分钟。6 PBS冲洗，5分钟×3次。7 显色剂显色（DAB）。8 自来水充分冲洗，复染，封片。冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育1~2小时或4过夜。3 PBS冲洗，5分钟×3次。4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育10~30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育10~30分钟。6 PBS冲洗，5分钟×3次。7 显色剂显色（DAB或AEC）。8 自来水充分冲洗，复染，封片。600C烤干,备用。 我用过的尼氏染色的方法，效果不错。1． 溶液配制：(1) 溶液A：焦油固紫0.2g, 纯水500ml(2) 溶液B：0.1M冰醋酸 冰醋酸3ml， 纯水500ml(3) 溶液C：0.1M无水醋酸钠 无水醋酸钠4.1g，纯水500ml(4) 溶液D：PH3.5~4.5醋酸缓冲液 B液94ml＋C液6ml(5) 工作液：A液10ml＋D液90ml 过滤后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。2． 具体步骤： 如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤开始；如果为冰冻切片，从步骤开始。 将凉干的切片放入纯水中3～5min。 切片放入焦油固紫染色液中1～1.5h。 切片放入纯水中洗去浮色。 切片放入70％－80％－95％的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。 切片放入特殊分色液中褪背底（1：1：1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。 切片放入100％乙醇，5min×3次；二甲苯5min×3次，透明封固。整个过程要保证切片不能干掉。3、结果尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配制：甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml2、染色步骤:（1）切片脱蜡至水（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟（3）用碱性乙醇分化液分化数秒（4）水洗（5）苏木素复染2分钟（6）水洗（7）脱水,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。 4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色， 直接免疫荧光法测抗原基本原理　　将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每