吉富罗非鱼mIgD基因恒定区序列的原核表达及多克隆抗体的制备.docVIP

吉富罗非鱼mIgD基因恒定区序列的原核表达及多克隆抗体的制备 　　摘 要：实验采用原核表达方法成功获得吉富罗非鱼mIgD基因恒定区融合蛋白，同时利用纯化的MIGD融合蛋白，制备了兔抗MIGD多克隆抗体。ELISA检测MIGD融合蛋白效价高达1∶512 000，说明MIGD蛋白具有较强的免疫原性，可以诱导罗非鱼机体产生相应较强的免疫应答 关键词：吉富罗非鱼；mIgD；原核表达；多克隆抗体 中图分类号 S943 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-10-04 Abstract：This experiment adoptsed prokaryotic expression methods to successfully obtain the constant region mIgD gene fusion protein，and polyclonal antibody against mIgD fusion protein was raised in a New Zealand pedigree white rabbit immunized with the purified MIGD fusion protein and the antibodytiter reached 1∶512000.This shows that the MIGD protein has strong immunogenicity，tilapia body can be induced to produce a strong immune response. Key words：GIFT strain of Nile tilapia；mIgD；Prokaryotic expression；Preparation of polyclonal antibody IgD是免疫系统中重要的免疫因子，主要在成熟的B细胞产生[1]。在硬骨鱼类中，IgD是继IgM被发现后的第二种免疫球蛋白，不同种鱼类IgD基因在结构上存在较大的差异，主要是由于其重链恒定区基因经过大量的剪切和复制，导致鱼体IgD基因结构差异较大。和IgM一样，IgD基因根据其剪切方式的不同，也分为2种型，即膜结合型IgD（mIgD）和分泌型IgD（sIgD）。mIgD主要是在B细胞膜表面作为抗原识别受体参与到免疫应答中，而sIgD则主要存在于血清和其它体液中，发挥着抗体的功能参与体液免疫中[2]。目前已经有多种鱼类的IgD已经被报道出来[3-6]，但IgD功能的研究仅限于基因结构的分析，其蛋白分子本身的功能却研究很少。一般Ig主要分为多变区（VH）、恒定区（CH）以及跨膜区（TM）等区域，而恒定区（CH）为Ig分子中最为重要的区域。为了研究恒定区生物学功能，本实验对已经获得的吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）mIgD重链基因恒定区进行克隆[7]，通过扩增获得编码的mIgD恒定区的基因序列，利用原核表达的方法构建融合表达载体，诱导表达后获取重组蛋白。通过制备重组蛋白的多克隆抗体，进一步研究重组蛋白的免疫原性，同时对多抗的特异性进行检测，以期为罗非鱼mIgD的功能研究奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验载体及菌株 质粒载体pET-32a（+）、受体菌菌株大肠杆菌DH5α、BL21均为本实验保存 1.1.2 实验动物 吉富罗非鱼（体质量为100g左右）采自湛江东海岛养殖基地，健康、有活力；新西兰纯种大白兔（体质量为2.1kg左右）购于广东医学院，暂养14d后用于实验 1.1.3 实验仪器 PCR仪：Bio-Rad公司；DYY-III-8B恒压恒流电泳仪：北京六一电泳仪厂；GDS-8000凝胶图象分析仪：美国基因公司；JY92-2D超声波细胞粉碎仪：HZQ-F160恒温振荡培养箱：上海南荣有限公司；HisTrapTM HP蛋白纯化柱：GE公司；BTI-MQX200酶标仪，美国BIO-TEK公司；上海新诺仪器设备有限公司等 1.1.4 实验试剂 IPTG、弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，试验所需酶类均购自大连TaKaRa公司；DNA切胶回收试剂盒、GeneJET Gel ExtractionKit试剂盒购自美国Thermo公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（货号：AB10058）购自生工生物工程（上海）有限公司；HRP-标记的鼠抗His-tag单抗、山羊抗鼠IgG、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司；其余试剂均为国产分析纯 1.2 实验方法 1.2.1 吉富罗非鱼mIgD基因恒定区原核表达载体的构建 根据已经获得的吉富罗非鱼mIgD基因的cDNA全长序列，利