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利用免疫荧光方法观察烟曲霉膨胀孢子刺激A549细胞不同时间CR3表达情况
一、实验目的
通过免疫荧光方法观察烟曲霉孢子刺激A549不同时间CR3表达情况。
二、实验材料
1、A549细胞（提前一天以1*105个/孔接种于预先铺有处理过的盖玻片（泡酸24h，用自来水冲干净后用去离子水冲，最后用双蒸水泡24h，双蒸水洗干净后盖上牛皮纸后烘干，高压灭菌烘干后放入生物安全柜中）的24孔板中）；烟曲霉膨胀6h孢子（将休眠孢子加入SDA液体培养基中，37℃、200转振摇6h，3000r/min离心10分钟收集膨胀孢子，再用含0.1%的吐温20的PBS3000r/min洗两次，然后计数）。
2、试剂：CD11b一抗（ab63317）,IF:1:30稀释；TRITC标记的抗小鼠二抗（中杉）；70%冰的甲醇（PBS配）；0.05%Triton（PBS配）；1%BSA（PBS配）；冰块或冰板； DAPI染色液（碧云天）（C1005）-20摄氏度保存；抗荧光淬灭封片剂（碧云天）（C1005）-20摄氏度保存。
3、仪器：倒置荧光显微镜（日本莱卡公司）（DMI3000B）；生物显微镜（正置普通）（日本奥林帕斯公司）（DX51）；普通倒置显微镜（日本莱卡公司）（DM2L）。
三、实验步骤
1、将细胞中原有培养基吸出，将孢子按MOI=10稀释入DMEM完全培养基中，加入处理组中，每组500微升，孵育至相应时间，除去培养液。室温PBS轻轻漂洗细胞3次，每次约30秒，镜下观察未吸附孢子是否洗干净。
2、冰的70%甲醇4摄氏度下固定细胞15分钟（每孔200微升即可）,除去甲醇，PBS轻轻漂洗3次，每次30秒，镜下观察细胞形态。
3、0.05%Triton X-100透化处理细胞5分钟（每孔200微升即可），PBS轻轻漂洗3次，每次约30秒，镜下观察细胞形态。
4、1%BSA室温封闭30分钟后，去除1%BSA.
5、向孔中加入1：30的一抗（用1%BSA稀释，每孔约50微升，400微升1%BSA+13.3微升一抗），将24孔板放在湿盒中避光，室温孵育1h，除去一抗溶液。PBS洗细胞3次，镜下观察细胞形态。（此后步骤注意避光保存）。
6、加入二抗（用1%BSA1:30稀释，每孔约100微升，800微升1%BSA+26.6微升二抗），湿盒避光保存室温孵育1h，除去二抗溶液。PBS洗细胞3次，镜下观察细胞形态。
7、加入DAPI染色液，盖住样品即可。室温放置3分钟-5分钟。
8、吸除DAPI染色液，用PBS轻轻洗3次，每次3-5分钟。 镜下观察细胞形态。
9、吸出液体，滴一滴抗荧光淬灭封片液于组织切片上，盖上破片，避免气泡产生。
10、将玻片周围液体吸干净，用指甲油封片，进行观察。
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