编号：农业微生物研究中心, 共6页.doc

编号：研究中心, 共 承担单位：福建省农科院研究所 课题编号： 课题名称： 课题负责： 子课题名： 子课题号： 子课题人： ：项目： 试验人员：试验负责：报告日期：20计数月份：20年月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院研究所 研究中心 电话: 0591 传真: 0591 试验 经过前期的一系列工作，已经完成了对阿维菌素5-OH的保护以及4‘‘-OH的羧基化等结构改造，也初步分离提纯出Bt蛋白晶体。这样就可以对其进行藕合了。可是这时出现了一个问题，那就是Bt蛋白溶于NaHCO3（pH 值10. 0）缓冲液，而阿维菌素衍生物却不具有水溶性，因此它们无法共存于同一种溶剂体系中，也就无法进行反应。现有的办法是进行两相反应或者改变其中一种或两种的溶解性。可是对两相反应的了解很少，并且实验操作起来相对会困难，因此暂且不考虑该方法。这样就只能改变物质的溶解性了。而蛋白质又相对较为脆弱，对其进行改造容易失活，那么，就只能选择改造阿维菌素以期增加它的水溶性了。而我们选择的是通过对阿维菌素进行PEG化来增加其水溶性。 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性，无毒，水溶性较高的亲水聚合物，其重复单元为氧乙烯基，端基为两个羟基，呈线性或支化链状结构。PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物，由于PEG 无毒及良好的生物相容性，PEG 已被FDA 批准可作为体内注射药用聚合物。药物的PEG 修饰是将活化的PEG 通过化学方法偶联到药物上的过程，即PEG化(PEGylation)。PEG具有高度的亲水性,在水溶液中有较大的水动力学体积,并且没有免疫原性。当偶联到药物分子或药物表面时,可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子,改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性,在其修饰的药物周围产生空间屏障,减少药物的酶解,避免在肾脏的代谢中很快消除,并使药物能被免疫系统的细胞识别【1】。 PEG最早用于药物修饰要追溯到1977 年，Abuchowsk【2】等用PEG 来修饰牛血清蛋白，发现可以有效地改变其免疫性质。在此后的二、三十年中，,聚乙二醇修饰技术得到了迅速的发展,成功地开发出多种PEG化的药品。在本实验中PEG的引入，既可以增加阿维菌素的水溶性又可以当作中间介质将阿维与蛋白连接起来，要是可以做成功，其实是一举两得。下面简单介绍一下对本实验可能会有帮助及指导意义的一些实验。 1.1 PEG对蛋白的修饰 因为本实验还要涉及到以后对Bt晶体的PEG化，因此在这里也介绍下PEG对蛋白的修饰。采用PEG修饰技术可以改变蛋白质的生物化学特性, 增加蛋白水溶性和稳定性, PEG 化的蛋白在保留天然蛋白质的内在生物学活性的同时, 能有效克服蛋白质类药物在临床应用中的一些缺点, 如可以提高血浆半衰期, 增强生物利用度等.为了使PEG 在较温和的反应条件下与蛋白质偶联,需将PEG 活化, 活化后的PEG 再与蛋白质分子上的氨基、巯基或羧基进行偶联。 1.1.1 氨基的修饰 蛋白质分子表面的氨基有较高的亲核反应活性, 因而是蛋白质化学修饰中最常被修饰的基团. 用于氨基修饰的PEG 的种类较多, 其中氰脲酰氯法为最经典的PEG 活化方法, 烷基化(alkylating) PEGs 和酰基化(acylation) PEGs 也是两种常用的PEG活化方法。姚文兵等【3】用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG-5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰.结果表明, 修饰后其热稳定性和耐酸碱稳定性有极大提高, 体内半衰期明显延长。 季波等【4】采用氰脲酰氯法先对聚乙二醇单甲醚6000 (mPEG-6000)进行活化，再以活化后的PEG 对牛血Cu, Zn-SOD 冻干粉进行化学修饰,制得PEG-SOD。与天然的SOD 相比, PEG-SOD 衍生物在耐热、耐酸碱以及抗酶解方面都有显著提高, 而抗胰蛋白酶的能力强于抗胃蛋白酶。 另外，这个实验中的氰脲酰氯也为我们提供了一个思路：或者可以将氰脲酰氯的三个氯分别以阿维菌素、Bt蛋白以及PEG所置换，合成一种新的物质。不过难题是三个氯处于同等的位置，要被三种不同物质分别替代，其操作难度会比较大。 1.1.2 巯基的修饰 巯基在蛋白质组成中通常含量不高, 但是位置确定, 因而可针对那些对活性影响不大、呈游离状态的巯基进行定量、定点修饰。目前可用于巯基修饰的活化PE