聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化 - 马光辉组.pdfVIP

第5 卷第1 期 过 程 工 程 学 报 Vol.5 No.1 2005 年 2 月 The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2005 聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化 1,2 2 3 1 2 2 杨瑞娥 ，贠 强 ， 陈 婷 ，谭天伟 ，马光辉 ，苏志国 (1. 北京化工大学化学工程学院，北京 100029; 2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080; 3. 北京科技大学生物工程系，北京 100083) 摘 要：采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰重组人粒细胞集落刺激因子 rhG−CSF ，考察了各因素对蛋白质平均修饰 度及体外生物活性的影响，并对修饰产物的稳定保存条件进行了初步探讨. 通过四因素四水平正交法和单因素实验结 合，优化修饰条件为：PEG 与G−CSF 摩尔比为25:1, pH 7.6 的硼酸盐缓冲环境，反应时间40 min ，反应温度22 ℃. 在 此条件下，PEG−G−CSF 的平均修饰度为50%，活性可保留40%左右. 研究还发现，不同的添加剂影响PEG−G−CSF 的保存稳定性，人血清白蛋白和甘露醇是两种效果最好的保护剂，在它们的存在下，PEG−G−CSF 溶液在4 ℃放置一 个月后活性保留92%，三个月后保留51%. 关键词：粒细胞集落刺激因子(G−CSF) ；单甲氧基聚乙二醇(mPEG) ；化学修饰；生物活性 中图分类号：Q511 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2005)01−0086−04 1 前 言 应条件进行优化，探讨了各因素对修饰度大小和G−CSF 生物活性的影响以及修饰度和生物活性之间的关系，同 [1] 1977 年，Abuchowski 等 用单甲氧基聚乙二醇 时确定了PEG−G−CSF 偶联物的稳定保存条件. (CH O−[CH −CH −O] CH CH −OH ，简写为 mPEG)对 3 2 2 m 2 2 牛血清白蛋白和过氧化氢酶(小牛肝脏)进行化学修饰 2 材料和方法 后，发现用聚乙二醇偶联之后的蛋白质免疫原性和抗原 性大大降低，表观分子量和在体内的循环半衰期明显增 2.1 仪器与材料 F−4500 荧光仪( 日本Hitachi 公司) ，450 型酶联免 加. 随后人们用mPEG 对L−天冬酰胺酶、超氧化物岐化 酶、α−干扰素、粒细胞集落刺激因子等多种药物蛋白进 疫检测仪(美国Bio−Rad 公司). 行了化学修饰，表明用mPEG 修饰后的蛋白可以减少人 荧光胺(Sigma), MTT(Sigma), RPMI1640 (Gbico 体对药物蛋白的免疫反应，延长药物在体内的循环时 BRL 公司), 96 孔细胞培养板(Costar 公司), rhG−CSF 效 [2] 价测定用参考品( 中国药品生物制品检定所), 间，同时达到减少注射频率和药物毒副作用的目的 . rhG−CSF(北医联合生物工程公司). 标准蛋白购自上海 粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimu-