Q1引物是如何合成的 - 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司.DOC

引物合成常见问题 Q1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 (1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5- OH的保护基团DMT，获得游离的5- OH； (2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5-OH仍然被DMT保护，3端被活化与溶液中游离的5-OH发生耦合反应； (3) 封闭：耦合反应中极少数5- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应； (4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。 合成处理 切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。 纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。 定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。 储存：分装抽干。 Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？ 合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。 Q4.需要什么级别的引物？ 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR扩增 base HEPD 60 base PAGE 诊断PCR扩增 40base , PAGE DNA测序 20base左右 亚克隆，点突变等 根据实验要求定 , PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE 反义核酸 根据实验要求定 PAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC Q5.需要合成多少OD数？ 根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。 Q6.如何计算引物的浓度？ 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算： V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量 引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。 Q7.如何计算引物的Tm值？ 引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size＊ ＊公式中，Size =引物长度。 Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？ 非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62. NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17 常规修饰基团分子量 5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5