基于MALDI 源生物质谱技术平台 - 扬州大学测试中心.PPT

标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 细胞处理、裂解、提取蛋白质； 等量混合对照与处理组蛋白质、SDS电泳、染色； 割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。 细胞代谢标记（SILAC） 生物大分子的分子量分析 BSA 某蛋白聚合体 MALDI 样品基本要求 磷酸盐缓冲液 50 mM 重碳酸铵 30 mM Tris buffer 100 mM 胍 (盐酸盐, 硫酸盐) 1 M Triton 0.1% SDS 0.01% 碱金属盐 1 M 甘油 1% 蛋白样品具体要求 挖点或胶内酶解操作过程中不可使用劣质国产枪头和指形管，防止塑料峰污染 样品防止角蛋白污染 胶粒大小：1.5mm3以下 胶内酶解试剂（色谱级） 染色方法：考染/银染（银染试剂中不能含有戊二醛） 种属名称，搜库要求（参数） LC-MALDI的样品中不要含有乙腈，最好进行过除盐步骤 UHR-TOF maXis 超高分辨飞行时间质谱仪 仪器型号：maXis 制造厂商：德国Bruker公司 质谱类型：四级杆-飞行时间 主要技术指标： 质量范围：m/z 50～2500 质谱功能：MS，MS/MS 分辨率： 50000 ( ESI+, m/z=1222 )； 45000 ( ESI-, m/z=1334) MS质量准确度： 优于0.8ppm (全扫描，ESI+, m/z=1222，内标校正) 优于2ppm (全扫描，ESI+, m/z=1222，外标校正) MS/MS质量准确度：优于2ppm (外标校正) 同位素丰度比：平均丰度比误差小于2% (调谐标样) 扫描方式：一级质谱全扫描(MS)，二级质谱全扫描(MS/MS) 电喷雾源(ESI源) 利用高电场使质谱进样段的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库伦斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈雾滴状，这时的液滴表面电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。 仪器功能及附件： 1) 离子源：配有ESI电喷雾电离源、APCI大气压化学电离源、nanoESI纳升电喷雾电离源 2) 戴安公司U3000高效液相色谱仪，配有DAD二极管阵列检测器，自动进样器，柱温箱 3) EASY-nLC纳升液相色谱仪 　 应用范围： 用于小分子有机化合物的定性分析，可提供精确质荷比和同位素丰度，推算分子的原子组成；用于中等极性和强极性大分子物质的定性分析，进行蛋白质组学等研究。 优点：高采样速率、高分辨率、高质量准确度、高质量数 Multiply Charged Ions ESI spectrum of HEW Lysozyme（溶菌酶） MW = 14,305.14 大分子样品会生成带多种电荷 (from 2 to 20 )的样品离子 A亚型 MW= 18363.5024 B亚型 MW=18277.4748 A亚型+B亚型 ESI图谱可以灵敏地反映蛋白质的构造 Native Azurin Denatured Azurin 大部分折叠、拼接或复合的蛋白质的质谱是非高斯分布 的，在图谱上只能观察到少量的峰，代表较高的m/z 值。 变性或open form 蛋白质/多肽较容易离子化，其谱图是多个高斯分布的峰。 胶和液相杂合分离路线 Agilent 1200-6460 QQQ 应用范围： 化工产品的纯度分析与杂质分析 食品中农药兽药残留检测（瘦肉精、抗生素……） 环境污染物检测（水中的藻毒素……） 药物的代谢物分析 氨基酸、多肽的定性定量 主要技术指标： 质量范围：m/z 5～3000；质量稳定度：+/- 0.1amu / 8hours； 质谱功能：MS，MS/MS 质量准确度：+/- 0.1amu；分辨率：单位质量分辨；动态线性范围：106；扫描速率：10,000amu/sec MRM灵敏度：ESI+ ：1pg (1.6 fmol) 利血平 信噪比 1000∶1 扫描方式：多反应监测(MRM)、全扫描(Full Scan)、母离子扫描、子离子扫描、中性丢失扫描、选择离子扫描 仪器名称 生产厂家 型号 质谱类型 主要应用 气质联用仪 Thermofisher Trace GC DSQ II 四级杆 有机化合物的定性和定量 液质联用仪 Thermofisher Surveyor LCQ Deca XP max 离子阱 有机化合物的定性与定量； 大分子的定性 液