年产1万吨聚羟基脂肪酸酯（PHA）高技术产业化项目.PPT

深圳市科创委技术创新计划项目 《脂肪酶产生菌Aspergillus sp.G55 基因工程菌构建及选育研究》 1.1 项目内容 脂肪酶又称甘油酯水解酶（lipases，EC 3.1.1.3）是一种生物代谢产物，可以催化脂肪水解为甘油和脂肪酸的酶，本项目研究菌种为黑曲霉Aspergillus.sp. 1.2 生物制造脂肪酶用途 （1）作为饲料添加剂使用 （2）改善面食制品质感和白度 （3）为洗涤剂的主要添加酶 （4）造纸过程添加生物酶实现生物脱墨 （5）制革中可以用于脱脂和脱蛋白质过程 （6）有降低低密度脂肪酸的功效 （7）可用于被污染环境的生物修复和石油炼制等 菌丝体培养时间对原生质体形成影响 不同渗透压稳定剂对原生质体形成和再生的影响 不同酶组合对原生质体形成影响 酶解时间对原生质体形成和再生的影响 图2.3 菌丝体培养时间对原生质体形成的影响 表2.5 不同渗透压稳定剂对菌株原生质体形成数量的影响 表2.6 不同酶组合对原生质体形成数量的影响 图2.4 裂解酶酶解时间对原生质体形成的影响 图2.5 不同酶解时间对原生质体再生率的影响 图2.6 不同渗透压稳定剂对原生质体再生率的影响 （1）原生质体融合 就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或者化学的或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，从而获得重组子的过程。 图2.8 钙离子浓度对融合率的影响 图2.9 PEG处理时间对融合率的影响 图2.10 PEG浓度对融合率的影响 （3）易错PCR 条件的优选 调整ep-PCR 反应体系中Mn 2+ 和Mg 2+浓度, 可以得到不同突变频率片段的多样性文库 （1）基础培养基 黄豆饼粉5 % 玉米淀粉1% 磷酸氢二钠0.2% 硫酸钾0.2% 碳酸钙0.5% pH自然 （2）最适营养成分考察 表2.7 主要碳源成分对菌种产酶的影响 图2.12 磷酸氢二钠浓度对产酶的影响 进行黑曲霉基因工程菌株的构建（实施中） E.P.Paul.Thierry博士（法国）工程菌构建研究 已构建工程菌株的筛选 常规菌株选育（实施中） 正交试验和BP优化培养基 发酵培养基进一步优化（实施中） 100L发酵罐试验（尚未开展） 论文及专利（撰写中） 经费使用安全，高效，节约 2.5 ep-PCR 方法定向改造菌种 （1） 原理 分子定向进化属于蛋白质的非合理设计范畴, 它不需事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制, 而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择) , 使基因发生大量变异, 并定向选择出所需性质或功能的目的分子，本实验目的是通过对于影响菌种产酶基因的改造实现产物的高积累 （2）ep-PCR方法 根据脂肪酶基因序列设计分别含NdeI，Bam HI酶切位点引物 正向引物: 5’-CCC GAATTCCATATGTCCCTGTTGATCCGT-3’ 反向引物: 5’-CCCGGATCCTCAGCGCTGAACTGG-3’ ep-PCR 循环条件: 94℃1min, 60℃1min，72℃1.5 min，30个循环 72℃延伸10 min a b 图2.11 不同条件下ep-PCR 扩增产物(1440bp ) 琼脂糖凝胶分析 a: Mn 2+浓度为0.15mmol/L，1-5条带Mg 2+浓度分别为0 3 4 5 6mmol/L b: Mn 2+浓度为0.30mmol/L，1-9条带 Mg 2+ 浓度分别为0 0.5 1 2 3 4 5 6 7mmol/L （4）突变文库的构建和筛选 ep-PCR 扩增产物经 DNA 纯化试剂盒纯化 AvrII 和 NotI 酶切扩增产物和质粒 lip 消化、连接, 转化至 E.coliJM109感受态细胞 将转化子转移至 LB 液体培养基中培养, 获得突变质粒 突变质粒 SalI酶切线性化 电转化毕赤酵母GS115 构成突变文库 菌落接种到96孔板培养并检验产脂肪酶能力 筛选出高活力的菌株 2.6 发酵培养基优化 1882 蔗糖 1760 葡萄糖 1990 麸皮 2230 淀粉 2460 酶活U/ml 玉米粉 碳源 2230 蛋白胨 2356 牛肉膏 2310 豆饼粉 2180 KN03 2200 NaN03 1562 酶活（u/ml） (NH4)2S04 氮源 表2.8 主要氮源成分对菌种产酶的影响