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SSR分子标记 胡玉龙 M110107260 SSR标记的简介及原理 SSR标记的步骤及分析 SSR标记引物设计 SSR分子标记 1 2 3 SSR （simple sequence repeat） SSR标记 简单重复序列（Simple Sequence Repeat ，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。 SSR标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术。 SSR标记的简介 SSR分子标记的分子学基础 微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了SSR标记。 SSR分子标记原理 根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR，电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析，从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调控和差异。 SSR标记原理示意图 SSR分子标记的优势 SSR在真核生物基因组中分布广 多态性丰富 其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗传信息量大 SSR通常为共显性标记，呈孟德尔式遗传 具有很好的稳定性和多态性 DNA用量少 PCR扩增的可重复性高 SSR分子标记的劣势 开发和合成新的SSR引物投入高、难度大 现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因 SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR扩增的效果 SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感 相对比较费时等等。 SSR分子标记的步骤 第一步：DNA 提取： 提取DNA并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。 第二步：PCR : PCR体系： 模板DNA 引物 氯化镁 4种dNTP混合物 PCR缓冲液 TaqDNA 聚合酶 PCR反应程序 ： 变性94 ℃ → 复性（或退火）50-62℃ → 延伸72 ℃，一般30-35个循环 SSR分子标记的步骤 第三步： 琼脂糖电泳检测扩增质量（1%-2%琼脂糖凝胶）；扩增产物电泳分离：一般用8%变性聚丙烯凝胶电泳检测扩增产物 第四步：染色（多采用银染法）： A.银染液的配制： 固定液(100mL冰乙酸加水稀释至1000mL)； 染色液(1.3gAgNO3、1．5mL37％甲醛，加水稀释至1000mL)； 显色液(30gNa2CO3、1．5mL37％甲醛0．2mL 20mg/mlNa2S203，加水稀释至1000mL)； 终止液(10％冰乙酸)。 SSR分子标记的步骤 B.银染法操作： 固定30min→去离子水洗涤30s，2次→染色30min→去离子水洗涤2次(每次不超过30S)?→显色至所要程度→去离子水洗30s终止显影。 SSR分子标记的步骤 第五步：结果分析 图1为一对引物对多对玉米亲本SSR电泳图 引物 设计 二 三 一 从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中查询 使用近缘种的引物 构建基因组文库,筛选SSR位点 SSR分子标记引物设计 构建基因组文库,筛选SSR位点 5锚定PCR 分离SSR标记 K可以跟任何核苷酸配对，V不能与A配对，R不能与G配对，其他核苷酸均可与它们配对。这样，VRVRV五个碱基一起构成了一个封闭碱基群。在PCR过程中，由于VRVRV不能与GA配对，该引物与模板DNA结合的时候，就不会在(GA)n重复区滑动，只会结合在如图1所示的位置上，以保证SSR位点的长度多态性不会丢失。 Thank you ! 共显性：说白了就是可以分辨出纯合的和杂合的。（如图示） 对于RAPD是随机引物，(可以理解只有正向引物，没有反向引物。)因此，它扩增出来的为引物结合位点到终点的长度。当然一条链上会有很多该引物结合位点，也就出现了很多片段。对于一个特定位点，我们可以理解只有一条正链可被扩增。因此，在该链上只有2种情况，有和没有。 对于SSR，有一对(正向引物和反向引物)。对于一个特定位点，两条链都可被