氨基酸代谢Metabolism of Amino Acids - 生物化学与分子生物学.PPT

原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 12. PCR实验的特异性主要取决于( ) DNA聚合酶的种类 反应体系中模板DNA的量 引物序列的结构和长度 四种dNTP浓度 循环周期的次数 13. 基因剔除(knock out)的方法主要被用来研究( ) A. 基因的结构 B. 基因的功能 C. 基因的表达 D. 基因的调控 E. 基因的突变 14. 反义核酸作用主要是( ) A. 封闭DNA B. 封闭RNA C. 降解DNA D. 降解RNA E 封闭核糖体的功能 15.PCR技术可以用于（　　　　） Ａ 病原微生物的微量检测 Ｂ 突变基因的筛选 C 法医学鉴定 D DNA序列分析 E 克隆目的基因 16. 克隆致病相关基因的策略包括( ) A 定位克隆 B 非定位候选克隆 C 功能克隆 D 定位候选克隆 E 随机克隆 17.基因芯片主要用于( ) A 基因表达检测 B 基因突变检测 C 基因组作图 D 功能基因组学研究 E 发现新基因 18. 酵母双杂交系统主要应用于( ) A 分析已知蛋白质之间的相互作用 B 分析蛋白质的功能域 C 分析未知蛋白质之间的相互作用 D 绘制蛋白质相互作用的系统图谱 E 设计药物 19. PCR reaction system include ( ) A specific primer B Klenow fragment C dNTP D ddNTP E 35S-α-dATP 20. The steps of PCR cycle include ( ) A renaturation B denaturalization C anneal D primer extension E primer termination 基因打靶的原理和基本步骤 首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利用细胞内的染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA，在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施“打靶”； 之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚( 受精卵分裂至8个细胞左右即为囊胚, 此时受精卵只分裂不分化) , 移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊胚一起分化发育成相应的组织和器官； 最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的胚胎干细胞保持分化的全能性, 因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。 基因打靶的原理示意图 基因功能研究的功能失活策略是通过观察，细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。 常用的方法主要有 基因敲除 基因沉默 二、采用功能失活策略鉴定基因的功能 基因敲除（gene knock-out）属于基因打靶技术的一种，其操作步骤和原理与基因打靶技术相同。基因敲除技术是利用细胞染色体DNA可以与导入的外源DNA在相同序列的区域发生同源重组的现象，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯和个体。 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失 基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。 近年来，条件性基因打靶（conditional gene targeting）系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确，效果更加精确可靠，已达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。 Cre/loxP系统作用原理示意图 这一技术亦存在一些缺点： 费用太高 周期较长 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这