免疫酶组织化学技术剖析.ppt

第三章 免疫酶组织化学技术 免疫酶组织化学技术 酶------辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶…… 酶标记已知Ab(或Ag) + 组织细胞内相应的Ag(或Ab) 抗原抗体复合物(酶标) 底物 有色沉淀 定位； 图像分析仪半定量 免疫组化方法 酶标抗体免疫组织化学 直接法 间接法 非酶标抗体免疫组织化学 酶桥法 PAP法、APAAP法 一、酶标抗体免疫组织化学染色法 （一）原理 直接法和间接法。 直接法--- 是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。 间接法---两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。 (注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。) 原理：将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。 缺点：浪费抗体、敏感性极低。 依靠化学连接（共价键）对酶及抗体活性有影响。 每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物。 酶标抗体法-直接法 酶标抗体法-间接法 原理：将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：只需一种酶标抗体即可 。 缺点：敏感性低，但优于直接法。 依靠化学连接对酶及抗体活性有影响。 免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确定该抗原的性质、存在的部位和含量。 酶 + 底物====不溶性的色素 标记酶: 辣根过氧化物酶 (HRP) 碱性磷酸酶(ALP) 葡萄糖氧化酶(GOD) β-D-半乳糖苷酶…… 显色反应 : 1 辣根过氧化物酶 HRP： 显色：产物棕褐色 HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DAB性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20℃贮存。 注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色 浓缩的DAB—按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值； 粉剂DAB----溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配---保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加H2O2 1 辣根过氧化物酶 HRP： 2 碱性磷酸酶 ALP： 显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。 2 碱性磷酸酶 ALP： 显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。 3 GOD(葡萄糖氧化酶)： 以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。 呈色反应注意要点： ① 底物浓度： 应够高，保证最大反应速度; ② pH值： 满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供; ③ 温度： 室温即18℃-22℃，或37℃； ④ 时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制， 以特异性显色清