分子生物学(基因组概述)剖析.ppt

Cui mie 2) 部分酶解+完全酶解 1200bp 1000bp 800bp 完全酶解 部分酶解 1200bp 1000bp 800bp 3000bp 1800bp 2200bp 1200bp 1000bp 800bp R R 部分酶解 1200bp 3000bp 2200bp 3)末端标记+部分酶解 * 3) 末端标记+部分酶解 4.1 限制性作图 B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 如果使用的限制酶在DNA上切点相对较少，构建限制性图谱就比较容易。 限制性作图更适用于小分子。如果DNA分子小于50 kb，通常选用6碱基识别序列的限制性酶来构建限制图谱。 对于大于50 kb的DNA分子，可以选用“稀有酶”进行构建。 稀有酶: 4.1 限制性作图 B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 选用识别序列为7或8碱基的限制性内切酶进行切割。如：Sap I (7)；Sgf I (8)。 选用识别序列所含基序在靶DNA分子中稀少的酶。如人类基因组中，5’-CG-3’序列就比较稀少，如果选用Not I（5’-GCGGCCGC-3’）进行消化，平均约10 Mb才有一个切点。 可用该技术构建原核生物和低等真核生物（酵母和真菌）等染色体较小的生物的限制图谱。限制性作图不能用于大型基因组。 4.1 限制性作图 B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 如果用普通琼脂糖凝胶电泳来分离大片段DNA分子，电泳分辨率会大大降低。 交变脉冲场凝胶电泳（PFGE）：1984年，Schwartz和Centor发明；这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。 4.1 限制性作图 B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小 正交变电场凝胶电泳（OFAGE） 电场转换凝胶电泳（FIGE） 等高加压均匀电场（CHEF） 正交变电场凝胶电泳 两对电极间的电场可以改变，每对电极与凝胶长度方向成45度角； 电场的每次改变都迫使DNA分子重新排列，从而提高分辨率。 4.2 荧光原位杂交（FISH） 4. 物理作图 用荧光探针进行原位杂交 原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法。 具有中期染色体的分裂细胞 甲酰胺 高度凝聚 形态可识别 4.2 荧光原位杂交（FISH） 用荧光探针进行原位杂交 用于原位杂交的探针的标记要同时满足高灵敏度和高分辨率两个条件，非放射性的DNA荧光标记技术能满足这一要求。 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，可以将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而检测出各探针的相对位置。 在过去，探针必须是相当长的DNA的分子，通常至少是40kb的克隆片段；随着荧光信号放大技术的应用，现在最小可以检测500bp的DNA片段。 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 通过荧光标记显示出DNA探针在染色体上的位置 一种封闭探针重复序列的方法 如果探针中含有一些重复序列，它可能会和染色体上的多个位点发生非特异性杂交； 因此，探针在使用前要和来自被研究组织中的未标记DNA混合； 用于混合的未标记 DNA可以是总的核DNA，但最好是富含重复序列的DNA片段。 这时探针只与特异序列发生杂交 4.2 荧光原位杂交（FISH） B. FISH应用的局限性 中期染色体是高度凝聚的，每条染色体都具有可识别的形态。 使用中期染色体的缺点在于，由于它的高度浓缩的性质，只能进行低分辨率作图，两个标记间至少相隔1 Mb才能分辨出来。 因此，中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色体上的大概位置，为更精细的作图做准备。 操作较繁琐，数据积累速度太慢。 4.2 荧光原位杂交（FISH） 更精细作图的两种途径： 机械伸展的染色体：通过离心产生的剪切力可将染色体伸展到正常长度的20倍，这样分辨率可明显提高，能够区分出相隔200-300 kb的标记。 非中期染色体：相比之下，分裂间期的染色体更为有用，因为此时的染色体包装程度最低，分辨率有可能达到25 kb以下。但染色体形态特征消失，失去了定位探针位置所必需的外部参照位点。因此，一般在获得粗略图谱后，用该技术来确定染色体一小段区域内一系列标记间的顺序。 B. FISH应用的局限性 4.3 序列标签位点作图（STS作图） 4. 物理作图 用STS技术绘制物理图是到目前为止最为有效的方法。 STS其实只是基因组中任何单拷贝的短DNA序列，长度在100-500bp，但要求序列已知且在染色体上有唯一的定位。 要得到至少