蛋白质和多肽氨基酸序列分析.pptVIP

第十章蛋白质和多肽的氨基酸序列分析;引言;蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级结构决定了蛋白质的高级结构及功能。 因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功能研究中不可缺少的部分。;蛋白质测序的研究历史;引言;引言;一级结构测定的基本流程 1. 拆分蛋白质分子的多肽链; 2. 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基; 3. 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较小的片段; 4. 对各肽段的氨基酸序列进行测序; 5. 重建完整多肽链的一级结构; 6. 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； 7. 酰胺基位置的确定。;测定蛋白质的一级结构前的准备工作 1. 样品纯度必须97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS，凝胶过滤法，沉降系数法 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数；;第一节 氨基酸组成分析;第一节氨基酸组成分析;二、特殊氨基酸的保护;氨基酸组成分析的目的; 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，一种可能是蛋白质的N端封闭，另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质物质，解决这个问题的很好途径便是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。;1;一、蛋白质或多肽的水解方法 水解是蛋白质氨基酸组成分析的第一步，作用是破坏蛋白质的肽键，得到游离的氨基酸，用于之后的定性定量分析。 这是极其重要的一步，因为水解质量的好坏将直接影响到最终分析结果的正确与否。; 虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵敏、更精确、更快速以及自动化方向发展和改进，但还没有一种单独适用于所有残基的，并且能在水解液中定量回收的水解方法出现，很多因素如温度、时间、水解试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全程度均有影响。 下面主要对一些常用的水解方法作简要介绍。;1、酸性水解 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最通用的水解剂。 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为20～24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。 ;相关措施： 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时，算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、Val-Val、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延长水解时间如水解92h甚至120h来解决。但是长时间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。 ;2、碱性水解 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮气后填充管，110 ℃水解22h。 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限于测定色氨酸的含量。 ;3、酶水解 用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。 优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白质，对样品的测定结果可能会有干扰。;常见蛋白水解酶及其作用位点;4、微波辐射能水解 微波是一种高频电磁波，其能量传递是通过分子的极化，而水分子的极化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和微波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十小时缩短到几十分钟。 因此，微波辅助蛋白质水解技术的出现大大提高了氨基酸组成分析的效率。 ;5、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析） 如果蛋白质样品采用电泳法(如SDS)分离，很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹