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第五章 化学酶工程 第一节 酶分子的化学修饰 第二节 抗体酶 第三节 印迹酶 第一节 酶分子的化学修饰 一． 酶的化学修饰原因 1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。（热、蛋白） 2． 作用的最适条件不符。（半衰期延长，最适PH扩大） 3． 酶的主要动力学性质的不适应。（Km增大，结合差） 4． 临床应用的特殊要求。 (异源蛋白-抗原-抗体-降低酶类药物抗原性） 二． 酶修饰的方向 1． 核酸水平 2． 蛋白质水平（化学修饰） 三． 酶化学修饰的基本原理（解决4个“ ？”） 1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 酶化学修饰的定义： （二） 酶化学修饰的方法及修饰剂 一． 修饰剂的要求 二． 酶性质的了解 三． 反应条件的选择 四． 酶修饰方法 一． 修饰剂的要求 1． 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋 白质的吸附性。 2． 修饰剂上反应基团的数目及位置。 3． 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。 二． 酶性质的了解 1． 酶活性部位情况 2． 酶的稳定条件、酶反应最适条件 3． 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼 性等。 三． 反应条件的选择 1． 反应体系中酶与修饰剂的分子比例。 2． 反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。 3． 反应温度及时间。 四． 酶修饰方法 1． 酶分子侧链基团的化学修饰 2． 有机大分子对酶的化学修饰 3． 蛋白质类及其他。 1. 酶分子侧链基团的化学修饰 一．几种重要的修饰反应 二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 三. 研究新热点 一．几种重要的修饰反应 1．酰化及其相关反应 2．烷基化反应 3．氧化和还原反应 4．芳香环取代反应 二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1．巯基的化学修饰 常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺 2．氨基的化学修饰 3．羧基的化学修饰 4．咪唑基的化学修饰 5．胍（gua）基的化学修饰 三. 研究热点-核酸类酶的修饰 RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。 方法：核苷酸置换修饰 2’-位置上的羟基去除 在残基上接上氨基酸等有机化合物 2. 有机大分子对酶的修饰 一. 概念 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。 二．常使用的水溶性大分子修饰剂 糖及糖的衍生物 高分子化合物 具有生物活性的大分子物质 3. 蛋白质类及其它 一．蛋白质类修饰 二．金属离子置换修饰 一．蛋白质类修饰 什么蛋白质具有优越性？ 血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多！ 常用方法 1．戊二醛法：戊二醛双功能基团 2．碳二亚胺法：碳二亚胺作为交联剂 3．活性酯法：☆ 3．活性酯法 （1）原理：根据多肽合成原理发展起来 （2）特点：反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触所可能产生的酶失活，减少了副反应的产生。 （3）工艺步骤： a 白蛋白琥珀酰化 b 活性酯形成反应 c 修饰反应 二．金属离子置换修饰 1． 概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。 2．常用离子 常用二价金属离子。 金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶 举例 将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。 （三） 修饰酶的性质及特点 一．热稳定性 二．抗原性 三．体内半衰期 四．最适pH 五．酶学性质的改变 六．对组织的分布能力变化 一．热稳定性 例：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可使该酶的活力提高到原有酶活力的2.25倍。 原因： 1．修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的结构刚性。 2．减少了酶分子内部基团的热振动。 热稳定性举例： 例： 过氧化氢酶：右旋糖酐：50℃/10min，40%-90% 溶菌酶：右旋糖酐：100℃/30min，20%-90% 糜蛋白酶：右旋糖酐：37℃/6h，0%-70% 糜蛋白酶：肝素：37℃/6h，0%-80% 尿酸酶：人血清白蛋白： 37℃/48h，50%-95% 二．抗原性 三．体内半衰期 体内半衰期延长 四．最适pH 有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化 例如： 猪肝尿酸酶的最适pH为10