仪器分析作业-高效液相色谱法和紫外吸收法在蛋白质测定中的应用.docVIP

高效液相色谱法和紫外吸收法在蛋白质测定中的应用 摘要：随着生物技术的迅速发展，蛋白质的研究越来越广泛，重要，蛋白质分离分析测定技术对蛋白质组学、生物化学及整个生命科学的发展具有十分重要的意义。本文重点介绍一下高效液相色谱和紫外吸收在蛋白质测定中的应用。 关键词：蛋白质；高效液相色谱；紫外吸收 蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的α氨基酸之间通过α氨基和α羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的复杂的生物大分子。而且随着生物技术的迅速发展，越来越多地在体外通过各种生物工程的途径被人工制造出来，造福于人类，近年来，随着人们对蛋白质分子结构的深入研究，特别是在后基因组时代，蛋白组学已经成为功能基因组学研究的重要领域，蛋白质分离分析测定技术对蛋白质组学、生物化学及整个生命科学的发展具有十分重要的意义。此外蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分 食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢，细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关，其分离与定性、定量分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床检验、诊断疾病、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。目前测定蛋白质含量的方法有很多，如高效液相色谱法，紫外吸收法等。 一 ．高效液相色谱法在蛋白质测定中的应用 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 它可用来进行液固吸附，液液分配，离子交换和空间排阻色谱分析。 高效液相色谱有五个特点： 压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 　　 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 　　 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。 　　 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析。 　　 分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多。 高效液相色谱法分离蛋白质的基本原理 HPLC液泵将流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品带人色谱柱，在色谱柱中各组分依照分配系数、吸附力大小、带电性质，乃至分子量大小的差异而被分离，并依次随流动相流至检测器，将检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。蛋白质在物理、化学及功能上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础，蛋白质的大小，形状，电荷，疏水性，功能等特性都可以作为不同影响因素来分离蛋白质。 A．高效亲和色谱 高效亲和色谱（HPAFC）可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质，尤其是一些疫苗、糖蛋白和抗体等蛋白质类物质的分离。也可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白、变性蛋白、化学改性蛋白等，因为亲和色谱分离蛋白质的基本反应就是抗原抗体反应 。 B．高效离子交换色谱 高效离子交换色谱(HPIEC)是基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将他们分离。而蛋白质正好有等电点的差异，在不同pH值溶液中带电性质会发生变化。HPIEC是根据蛋白质分子在一定pH值和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。这种技术已经成功地应用于分离大多数的水溶性蛋白质，包括水解以后的多肽乃至氨基酸，并且当选择流动相的pH值合适时，能维持蛋白质的生物活性。 根据蛋白质的pH不同，又可分为阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。大多数蛋白质在生理pH值6—8时，都带负电荷，因此常用阴离子交换色谱来分离采用阴离子交换色谱分离乳 蛋白时，一般是有针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好，如分离骨桥蛋白时，纯度可以达到85％以上，但是如果要将大多数常量蛋白质都同时得到分离，则必须与其他手段联用。 对于一些碱性蛋白例如乳品中一些等电点较高的蛋白质采用强阳离子色谱的分离手段则更 为有效。 C高效疏水色谱 高效疏水色谱是用来分离构象不稳定蛋白质的技术之一，其分离机制是用水性缓冲液代替了有机溶剂；以键合氟化物作固定相，用SDS 或 CTAB作流动相的胶束高效液相色谱中，胶束提供了一个溶质溶解的非均相环境，可用于蛋白质的分离,近年来，人们将非线性色谱论应用于蛋白质分离中，更加完善了高效液相色谱技术。在实际应用中，特别是复杂样品，通常采用几种分离模式结合使用才能获得理想的目标