大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养概要1.docVIP

大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养 南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012年10月 一、试剂 Poly-L-lysine（Sigma,P2636） DMEM（Invitrogen,11995-065） FBS（Invitroge,10099-141） Neurobasal（Invitrogen, 21103-049） B27（Invitrogen ,17504-044） GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061） HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112） 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056） DPBS（HyClone，SH30028.01B） dd H2O 10％水合氯醛 75％酒精 二、器械 手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x1 200 ml小烧杯（盛放胎鼠） 200目不锈钢筛 细胞计数器（求精） 50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790） 6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599） 直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010） 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1） 过滤器（Millex-GP, SLGP033RB） 注射器：50ml、5ml各 1 Pipette and pipette tips 冰袋、手套、棉球、棉签 Day 1 1、消毒 1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。 1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。 2、包被培养板 2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。 2.3 以PLL包被培养板，量以覆盖培养板底面为宜。6孔板：1 ml per well；24孔板：0.5 ml per well；96孔板：0.1 ml per well。过夜。 3、配置培养基、消化酶 3.1 DMEM with 10% FBS FBS：DMEM=1：10 取FBS 4ml、DMEM 40ml加入50ml离心管中混合。 3.2 Neurobasal-B27-Glutamine Medium Neurobasal：B27=50:1 Neurobasal：GlutaMAX =100:1 取Neurobasal 50ml、B27 1ml、GlutaMAX 0.5ml，加入50ml离心管中混合。 3.3 0.125％胰酶 取0.25％Trypsin-EDTA 5ml,用HBSS稀释至10ml。 将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。 4、消毒 操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。 Day 2 1、消毒 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。 2、洗板 用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。 3、解剖孕鼠 3.1 将已消过毒的解剖工具和已乘HBSS的小烧杯端入动物房。 3.2 麻醉：取10％水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。 3.3 75％酒精消毒切口部位。 3.4 开腹（尽量开口大一些，便于后面操作） 使用1把组织镊、1把组织剪。 3.5 分离胎囊。 换用另一幅直/弯镊、组织剪。 3.6 将分离出的胎囊放入HBSS中。 4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上进行） 4.1 将盛放胎囊的烧杯放进操作台。 4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。 4.3 取3个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。 将胎鼠从胎囊中取出，剪去头，将胎头放入一个培养皿中。 4.5 用两支显微镊撕开脑膜，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的胎鼠都同样处理）。 4.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片 5