水泡性口炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的检测方法研究论文.pdfVIP

第27卷增刊 内 蒙 古农业大 学 学 报 v01．2702S 2005年7月 ofInner Jul．2005 Journal MongoliaAgrieulmra[University 文章编号：1009—3575(2005)02S一0050—04 水泡性口炎病毒和牛病毒性腹泻病毒 的检测方法研究’ STUDIESONDETECTIONMETHODSFORVSVANDBVDV 杨桂梅1，商洪2．徐自忠3．花群义3，周晓黎3 (1． 昆明医学院一云南省天然药物药埋重点实验室，昆明650031； 2． 云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；3．云南省出人境检验检疫局动检处，昆明650228) 、 摘要： 进行检测．结果均为阳性，而对反刍动物病毒性疾病相关病毒进行检测，结果均为阴性。采用单项PCR和二重 PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法都能扩增出预期的目的片断，符合率100％。 关键词： 水泡性口炎病毒；牛病毒性腹泻病毒；PCR；核酸检测 ViralDiar— tisVirus，vsv)引起的牛、马、猪和鹿等多种动物的一种病毒性传染病。牛病毒性腹泻(Bovine ViralDiarrhea rhea，BvD)是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine 染病f1]。它们是严重危害养牛业发展的两种最为常见的传染病，在世界许多地区广泛流行，并造成严重的 J，运用特 经济损失[2,3】。在我国进境动物检验检疫中，水泡性口炎和牛病毒性腹泻是必须检疫的两大疾病-4 测，只适用于流行病学调查，而不能确定是否正处于感染状态，并且都存着敏感性差、特异性不强或耗时等缺 点[7,8]。随着分子生物学研究的不断深入和PCR技术的出现，为动物疫病的诊断和检测提供了快速、敏感、 快速检测和防制提供了一个新手段。同时为进一步在临床上使用多重PCR方法诊断和检测这两种疫病提供 了参考。 1材料和方法 r 1．1毒株来源 病毒(EHDv)等均引自美国国家兽医实验室，云南省出人境检验检疫局动检实验室保存。猪瘟兔化弱毒株 (HCV，参考株)由云南生药厂提供。 1．2细胞制备 己制备。 +警萎是智；2云0南05省-0计6蚤-2科0技攻关习i目资助谭厝(编号：云计辩253号 增刊 杨桂梅等：水泡性口炎病毒和牛病毒性睡泻病毒的检测方莹研究 51 1．3引物设计与台成 和BVDV模板的2对引物，引物由大连宝生物公司合成，云南省出入境检验检疫局动检实验室保存。 1．4试剂盒与工具酶 Marker等分子生物学试剂均购自大连宝生物公司。 (HPRI)、Taq酶、DNA 1．5病毒核酸RNA提取 所有核酸均应用GibeoBRL公司的TRlzol试剂盒提取，具体操作步骤按试剂盒说明进行。 1．6反转录 。 录酶5--10min，一20℃保存或立即进行PCR扩增。 1．7 PCR扩增反应 1tzl(25pmol乍1)，Taq酶0 蜡覆盖，按预先设定的程序进行PCR扩增，扩增产物4℃保存或立即电泳。 1．8 PCR反应条件优化 式。 1．9 PCR产物的分析 PCR产物与2,ul加样缓冲液混合，用1 取5,d DNA 锭)，50min后