大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁异常堆积调节作用.doc

大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁异常堆积调节作用 　　[摘要] 目的 探?大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁异常堆积的调节作用。 方法 购买首都医科大学实验动物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠，依据随机数字表法将大鼠分为低氧组（n=14）、低氧+硫氢化钠（NaHS）组（n=12）、对照组（n=12），建立大鼠HPH模型，监测其血流动力学，测定其血浆H2S含量，检测其肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，最后进行结果判定与半定量分析、统计学分析。 结果 低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P 　　[Key words] Hypoxic pulmonary vascular remodeling of rats； Hydrogen sulfide； Collagen typeⅠand Ⅲ； Abnormal accumulation of pulmonary vascular wall； Regulation 低氧性肺动脉高压（HPH）的病理基础主要为肺血管重塑，而在低氧性肺血管重塑中，胶原重塑占有极为重要的地位，该领域的重要课题就是研究其调节机制[1]。以往临床普遍认为[2]硫化氢（H2S）属于毒性废气，最近临床发现[3]，心血管系统会内源性生成H2S，同时其具有重要的病理生理学效应，在调节心肺血管功能的过程中，H2S属于新型气体信号分子，能够在极大程度上缓解低氧诱导的肺血管重塑及肺动脉高压。本研究探讨了大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁异常堆积的调节作用，现报道如下 1 材料与方法 1.1 实验动物 2016年1～6月购买首都医科大学实验动物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠（批准号：091017），体重200～1800 g，平均（190±10）g，依据随机数字表法将大鼠分为低氧组（n=14）、低氧+硫氢化钠（NaHS）组（n=12）、对照组（n=12） 1.2 方法 1.2.1 大鼠HPH模型 低氧舱有缝隙相通于外界大气，能够为舱内气体以较慢的速度进出提供良好的前提条件，从而始终保持舱内气压和大气压的平衡。在进行低氧处理的过程中在低氧舱内放置大鼠，将氮气通入舱内，将舱内的部分氧气替换掉，从而有效降低舱内氧气浓度。用小风扇不断混匀舱内混合气体，采用上海雷磁公司生产的RSS-5100型氧浓度监测仪对舱内氧浓度进行随时监测，对向舱内注入的氮气流量进行控制，途径为对减压阀及气体流量表进行调节，保持舱内氧浓度为（10.0±0.5）%。在常压低氧舱内放置低氧组、低氧+NaHS组大鼠，舱内O2、N2分别占10%、90%，每天10：00～16：00连续低氧6 h，每天1次，共持续3周。低氧前给予低氧+NaHS组大鼠腹腔注射新鲜配置的14 μmol/kg H2S供体NaHS溶液，每天1次，给予低氧组、对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。三组大鼠具有相同的饮食饮水条件。达到低氧性肺动脉高压大鼠诊断标准，提示造模成功 1.2.2 血流动力学监测 完成低氧后给予大鼠腹腔注射1.2 g/kg体重乌拉坦麻醉，肺动脉、颈动脉插管分别对肺动脉平均压（mPAP）、体循环平均压（mAP）进行测定。将胸腔打开，取出心脏，分别对右心室（RV）、右心室（LV）+右间隔（SP）进行称量，然后计算RV/（LV+SP） 1.2.3 血浆H2S含量测定 将0.5 mL 1%醋酸锌加入试管中，然后将0.1 mL血浆标本加入其中，混匀后将0.5 mL 30 mmol/L三氯化铁+0.5 mL 20 mmol/L对苯二胺盐酸盐加入其中，在室温下进行20 min的孵育，之后将1 mL 10%三氯醋酸沉淀蛋白加入其中，将2.5 mL蒸馏水加入其中将体积补足至5 mL，离心 5 min，将上清液吸出来，在670 nm处对上清液的吸光度（A）值进行检测，然后计算上清液中H2S含量，在此过程中运用亚甲蓝分光光度法，严格依据标准曲线 1.2.4 肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白检测 采用天津TBD公司生产的Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化试剂盒对肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白进行检测，采用武汉博士德公司生产的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA原位杂交试剂盒对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA原位杂交进行检测 1.3 结果判定与半定量分析方法 阳性信号的标准为光学显微镜下棕黄色颗粒[4]。运用半定量积分方法分析肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原表达强度，随机检测每张切片中的10条肺小型、中型肌性动脉，外径分别在50 μm以下、50～150 μm之间[5] 1.4 统计学分析 采用统计学分析软件SPSS10.0分析数据，计量资料用（x±s）表示，多组均数比较用单因素方差分析（ANOVA），