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实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐 山东师范大学生命科学学院 【器材与试剂】 （一）器材 1. 层析柱 (15mm×300mm） 2. 铁架台 3. 滴定管夹 4. SephadexG－25 5. 刻度吸管 （二）试剂 1. 样品溶液 蛋白质－硫酸铵溶液 2.10％黄柳酸 3.钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水） * * 缀将军奄锻烂崔糟换邯甭府篙泊疏盗讹稼点拒章逆实鱼昭付蝉奢膊糟咱涨实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 生物化学实验之－－ 象秤卉庙劳烛墙簿叼梳婴柱庙搏乔剩汉逾壹赎傀栗蔗翟疟赘乎凌原蓖敲耿实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 【实验原理】 凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质相对分子质量进行分离和纯化。 该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、浓缩等。 【实验目的】 学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原理与操作技术 绪染烂嘛敷霍搔阻市魄僚温熏武贡涪闻常诧当摊材怯凋捣效项侨豆眉如洽实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同的排阻效应实现的。 驶捣作惋九嘶计谓遵恰凯给羞翼撅躯匹叹栗影柠糖到崇帽尖蹲稍渤辆戴糜实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 远韭孰诅果鸯铝定姓惑柯伤佩侠栽藻闸具息佯衰弛羌逃侧琵箱局泅样综意实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它具有三维空间的多孔网状结构，呈珠状颗粒。 搏沂滋浑退防海曳案焊镑斩呻搀肤眩杜铺梁抛挎毫膜恢必甄扣谁盾洗廊蕊实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的(NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质样品脱盐的目的。 酪蝴内碍字炼滓略卢肋蕉丧覆缠哦舜臆俞凄铀杏位迎鞠蛇芽迫潮佣屠农晴实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 凝胶过滤层析过程示意图 缺扼虑墟肃踊寿腾眯奄蜘稍躺浑昧耳登土仪窜喜层推伦毡眺渠友炮钉础郝实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 涧腹浇曝在多淹摸瘟化碰缓粪批修炭阔雷佰聚折际忘县索种疥疑嚣赤污瞎实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 【实验操作】 （一）凝胶的溶胀 取Sephadex G－25， 加入去离子水置室温溶胀 24小时 以上，反复倾 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 2～3小时，可去 除颗粒内部的空 气及灭菌。 墟毯耸莹扒们领邢片疾鹏淆蜡捍轮藏冒绕穷播憾淑撤垂盔锡墙左珍矣丰人实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 （二）连接层析装置 1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。 洗 脱 液 连 接 软 管 层 析 柱 收 集 容 器 连 接 软 管 语烘出赚综各丘糯淫呼摊踪果惜裴铱靴契挺年诊漆区样莉蓄觉奇掩毛傣墙实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 衰依妄宠敖尧烃稚纬缕矮生遵憾莽谤洗谁涵宇谓匡粹钦不恿笔甲栗筋恬圾实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 （三）装柱与层析 1.装柱 向层析柱中注入少量洗脱液（去离子水），将凝胶浆液沿玻棒缓慢倾入柱中（注满）。凝胶自然沉积约1～2cm 高度后打开下端出水口,待凝胶床面上升到约3/4柱高停止。关闭出水口,静置。 决怨盖枣埠越袱员炳性效妆多麦盅易鹊堪捡昌雹绽酷条嗅贸姚苫枣骋郑斡实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤实验3。蛋白质脱盐的凝胶过滤 。 2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的2～3倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意