HBsAg基因在酵母细胞中表达系统的建立.docVIP

HBsAg基因在酵母细胞中表达系统的建立 医学1201班 陈伟强 201278020101 詹少浪 魏显鉴 1.在NCBI上查找HBsAg蛋白的序列。 窗体顶端 窗体顶端 sttstgpcrt ctttaqgtsm ypsccctkps dgnctcipip sswafgkflw ewasarf 窗体底端 TCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCACGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTC 3.分析序列是否要优化： 4.对序列进行优化： 4.1优化原则 密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，它引起了同一密码子在不同生物体之间，蛋白的表达水平之间以及同一操纵子的不同部位间利用率的改变。引起这种偏爱性差异的主要原因是不同细胞内可用的tRNAs量的差异。因此优化翻译系统最佳的方法就是保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡。如在大肠杆菌中，AGG和AGA所对应的tRNA分子就很少，这种差异很明显会影响基因的表达。 将低利用率的密码子替换成宿主常用密码子： 通常基因中包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，甚至当这种密码子存在与蛋白簇间或者N末端的时候表达量会更少。在不改变氨基酸序列的前提下将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子能提高功能蛋白的表达水平。 去除问题密码子： 任何来源的密码子如果在宿主生物体内的利用率低于5%到10%时, 就会出现表达抑制，当这些低利用率密码子临近或相连时, 对蛋白表达的影响更大。去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子能够防止低表达或者不表达。 4.2序列分析结果： 4.3序列优化结果： 对密码子优化得到序列： TCAACCACCAGCACCGGACCATGCCGAACCTGCACCACCACCGCTCAAGGAACCTCAATGTATCCCTCATGCTGCTGCACCAAACCATCAGACGGAAAATGCACCTGCATTCCCATCCCATCATCATGCGCTTTCGGAAAATTCCTATGCGAGTGCGCCTCAGCCCGTTTC 5.启动子引物设计： AOX1： 5’端：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ 3’端：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ 6.启动子和目的基因结合： 使用Hpa1接头连接形成AOX1-HBsAg结合体 7.载体选择：pPICZα A 载体 8.目的基因载体合成及转染： 对AOX1-HBsAg结合体设计引物 5’端：5’-AGATCT（BgI II酶切位点）GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ 3’端：5’-GGATTC（BamHⅠ酶切位点）CCCTTTCTTTCCCCTTGTTTTCCAT-3’ 目的基因载体合成：利用BgI II和BamHⅠ双酶切质粒pPICZα A 载体和AOX1-HBsAg结合体，再连接纯化得到含目的基因载体。 质粒转染进酵母细胞中：LiAc法 窗体底端 1