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基于响应面法优化乳脂肪酶解工艺分析 材料与方法 1.材料与试剂: 新西兰无水奶油(上海爱普香精香料有限公司)；Palatase20,000L（丹麦诺维信公司）；0.2mol/L磷酸盐缓冲液(食品级)；0.1mol/L氢氧化钾标准溶液（分析纯）；95%乙醇（分析纯）；石油醚（分析纯）；酚酞；氢氧化钠-乙醇溶液（分析纯）；0.5mol/L盐酸标准溶液（分析纯）；中性乙醇（自制）；去离子水（自制）。 2.仪器与设备:ZNHW-Ⅱ型智能恒温电热套，巩义市予华仪器有限责任公司；PL203型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JB90-SH型数显恒速强力电动搅拌机，上海标本模型厂；DHG-9073B5-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；智能数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司。 3.试验方法 原料奶油基本成分分析方法:脂肪含量的测定：酸水解法GB5009.6-2003；蛋白含量的测定：微量凯氏定氮法GB5511-2008；水分的测定：干燥法GB5497-1985；灰分的测定：马福炉灼烧法GB5009.4-2010；过氧化值的测定：碘量法GB5538-2005；酸价的测定：滴定法GB5530-2005。 酶解产物的制备及处理:取150g无水奶油于0.2mol/L磷酸缓冲液中，将此混合物置于三角瓶中，加入0.25%的酶在50℃、以170r/min搅拌下进行酶解反应，分别在2小时、4小时、6小时、8小时、10小时取适量的反应物测定其酸价和皂化价，以脂解率为评价指标，在各个不同反应阶段，研究不同的酶添加量、底物浓度、酶解时间及pH对酶解产物的影响。 脂解率的测定:测定酶解反应混合物前后的酸值（AV）和皂化值（SV），根据公式（1-1）来计算脂解率：脂解率%=反应前后酸价变化含量/反应后的皂化值times;100（1-1）式中：皂化值的测定[17]：约称量2g酶解产物加入到25ml氢氧化钠-乙醇溶液于锥形瓶中，接上回流冷凝管，在恒温85℃的水浴锅中煮沸约30分钟，待煮液透明后，取下回流冷凝管加入中性乙醇溶液10ml。向锥形瓶中滴加酚酞数滴，趁热用盐酸滴定红色消失。 4.奶油酶解工艺条件优化 单因素实验结果表明，当加酶量为底物干重的0.25%时与0.3%时基本保持水平，这时的脂解率不再随加酶量的增加而增加，同时考虑到生产工业化的成本，因此选择底物干重的0.25%作为酶添加量。同时随着酶解时间的增长，脂解率也会不断的增大，但酶解的目的不在追求脂解率的最大化，而在于能得到风味最佳的酶解基料，同时在单因素反应系列中不难发现，酶解反应到最后几个小时，脂解率基本保持一致，不再随反应时间增长而增大。此外，若酶解时间过长会导致长链脂肪酸释放过多，以至于基料带有明显的皂味；若酶解时间过短必会影响到中短链脂肪酸的释放，导致基料风味有缺陷，增香强度不够[18]，所以初步选定酶解时间为6小时，以底物浓度、酶解温度和pH值3个因素作为自变量，并以单因素试验结果为依据，以脂解率为响应值，利用Design-Expert7.0设计三因素三水平试验方案，建立二次回归方程拟合因素和响应值之间的函数关系，采用响应面分析法来确定最佳的酶解条件。 结果与讨论 1.原料奶油基本成分:酶法制备奶味香精基料可以选择多种原料，不同奶油原料有着不同的风味特点，为制得气味自然，滋味浓厚感突出的增香产物，除了乳脂肪外还需要适量能溶于水的小分子乳蛋白呈味物质。原料奶油基本成分见表1。 2.单因素试验结果 酶添加量对脂解率影响:在反应体系总量150g不变的条件下，固定奶油底物和缓冲液的相对质量比为85%，反应温度为50℃，pH为8，分别考察不同酶添加量（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）对脂解率的影响，并且分别在2小时、4小时、6小时、8小时和10小时取样分析不同酶解时间对整个反应的影响。结果如图1所示。图1结果表明，随着加酶量的增加，脂肪酶Palatase20,000L对无水奶油的酶解作用逐渐增强，当加酶量超过0.25%底物干重时，脂解率增加趋势变缓，说明酶已经达到饱和浓度，而且反应在6-10小时这个间段与0.3%底物干重时反应体系几乎重叠，说明当反应时间大于6小时，脂解率变化不明显，继续增加酶浓度及反应时间对酶解率的影响不大，所以选择最适酶添加量为0.25%底物干重。 底物浓度对脂解率的影响:脂肪酶在油水界面上具有较大的活性，因此催化作用需要有一定的水分来维持酶分子的活性构象，同时改变其分子构象暴露活性中心，使酶处于激活状态而表现一定的催化能力。当水分含量过低或过高时，酶分子的催化部位就不能和水分子紧密接触，进而不能很好的维持酶的活性分子构象，导致酶解能力降低[19]，因此，油脂水解需