重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究论文.docVIP

　　重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究论文 丁克祥 董萍 郑永晨 杨永鹏 朱晓亮 韩晋云 单志新 丁宇 丁振华 【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aNPY转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethods The rebinant plasmid pET28aNPY ed atography. Then bioinformatic analysis of the NPY protein id pET28aNPY expressed rebinant human NPY protein. Highly purified NPY fusion protein atography. Related biological characteristics of NPY id pET28aNPY can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. NPY′s biological characteristics are predicted, ent. 【Key atics 人神经肽Y(Neuropeptide,NPY)是一个由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢和外周神经系统。此外,NPY也存在于其他组织、器官及腺体中。NPY影响摄食行为、激素分泌、心血管功能、调节体温、生物节律、性行为及情绪等各种生物功能,故越来越受到人们的重视。NPY释放后主要通过NPY受体起作用，不同受体起不同的作用,各组织所含受体种类及分布密度也不相同〔1，2〕。近来研究表明NPY可在局部作用于内皮细胞及脂肪细胞上Y2受体，促进局部脂肪组织生长。而且在NPY的作用下，局部脂肪移植物可存活更长时间不被机体吸收〔3，4〕。据此，理论上不仅可通过局部增加NPY的量，使更多的NPY作用于Y2受体促进该部位脂肪组织的增加;还可通过局部注入NPY抗体，使其中和游离的NPY蛋白，减少NPY与Y2受体的结合而达到该部位脂肪组织减少的效果。即以NPY为靶标，促进脂肪组织的转移。为此,本研究用基因克隆技术在大肠杆菌中制备NPY的融合蛋白,一方面获得高纯度的NPY蛋白，另一方面所得的蛋白制备NPY抗体,以便用于脂肪转移和肥胖代谢综合征的临床前研究。 1 材料与方法 1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aNPY的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组人NPY融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aNPY的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5 ml LB (Kan+)液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日取培养过夜菌液500 μl再接种于50 ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1 mmol/L，37℃继续诱导培养4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50 μl，混匀，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min，每个样品取20 μl上样于15%的SDSPAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2 h，然后脱色，拍照记录结果。 1.2.2 包涵体的释放 据上所述，在2 000 ml的摇瓶中装500 ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃以5 000 r/min离心15 min，收集菌体沉淀;加入25 ml PBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃ 12 000 r/min离心30 min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25 ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃ 12 000 r/min离心细菌冻融液30 min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25 ml，吹打混匀;置冰上对