重组人血管内皮生长因子D诱导鸡胚尿囊膜血管增生论文.docVIP

　　重组人血管内皮生长因子D诱导鸡胚尿囊膜血管增生论文 陈浩 丁秀云 高媛 柳晓兰 高建恩 孙启鸿 【摘要】 为了表达和纯化具有生物学活性的人血管内皮生长因子(vascular endothelial groan VEGFD Induces the Angiogenesis of the Chick Embryo Chorioallantoic Membrane Abstract Vascular endothelial groent of the embryonic vascular system and pathological lymphangiogenesis. The study ed to express and purify the GSTVEGFD fusion protein, and to explore the angiogenesis effect of VEGFD. The total RNA human fetal lung tissue, and the mature form of VEGFD erase chain reaction (PCR), then the plasmid pGEX5X1/VEGFD ed E.coli BL21DE3.The results shoolecular mass of this fusion protein ore than 15% of the total bacteria proteins.The fusion protein ulate the proliferation of human erythroleukemia cell line（HEL） cells. The data of chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) experiments indicated that GSTVEGFD could induce the CAM angiogenesis. It is concluded that the GSTVEGFD fusion protein ay provide an experimental model for the investigation of the VEGFDinduced angiogenesis and lymphangiogenesis. Key bnyo chorioallantoic menbreme 肿瘤转移通常是人类癌症致死的主要原因之一。目前认为，肿瘤转移的通路主要有以下三种方式：第一，肿瘤细胞浸润血管，直接进入血道形成转移灶；第二，通过侵入已存在的淋巴管进入淋巴循环系统，进而通过淋巴血循环转移到新的组织中形成转移灶；第三，肿瘤细胞从实体瘤上脱落，直接种植到周边组织形成转移。在这些过程中，肿瘤细胞分泌各种生长因子，刺激肿瘤生成新生血管和淋巴管（lymphangiogenesis），进而促进恶性肿瘤淋巴转移，其中血管内皮生长因子家族(vascular endothelial groily， VEGF)及其受体血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial groology domain, VHD）糖蛋白的成熟形式，提高了与VEGFR2，VEGFR3的结合能力［6］。本研究从人胎肺组织中克隆VEGFD基因的VHD片段，在大肠杆菌中进行表达，生物学活性检测结果表明重组GSTVEGFD不仅具有与VEGFR3/Fc结合的活性，还具有刺激红白血病细胞系HEL细胞生长和促进鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成的作用。 材料和方法 主要试剂 pGEX5x1表达载体和抗GST单克隆抗体均为Amersham公司产品；大肠杆菌BL21（DE3）菌株购自Novagen公司；GST预装柱及相关的纯化设备为Amersham公司产品；PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和pGEMT连接试剂盒均购自Promega公司； 各种限制性内切酶购自Takara公司；抗VEGFD单克隆抗体购自R D system公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为中杉金桥公司产品；HEL细胞购自中国医学科学院细胞库；MTT为Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯。 VEGFD目的片段（VHD）的获得和重组表达质粒的构建 根据VEGFD的VHD片段的编码序列，设计合成PCR反应引物：正向：5′CCGGAATTCTTTGCGGCA ACTTTCTATGACATTG 3′；反向：5′ ATAAGAA TGCGGCCGCTCTTCTGATAATTGAGTATGGATGG 3′。从人胎肺组织中提取总RNA，用Invitroge