阿托伐他汀对醛固酮诱导心脏成纤维细胞内皮素表达的影响论文.docVIP

　　阿托伐他汀对醛固酮诱导心脏成纤维细胞内皮素表达的影响论文 武宇洲，崔炜，李淑琴，张雷，鲁静朝，张冀东，都军 【摘要】 目的：研究阿托伐他汀对醛固酮诱导大鼠心脏成纤维细胞（CFs）内皮素（ET）表达的影响.方法：以培养的新生SD大鼠CFs为实验模型，放免法检测CFs培养液中ET水平.freelRNA的表达.结果：醛固酮（1×10-7mol/L）组CFs培养液中ET水平和CFs中的ET1含量及ppET1mRNA的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P 0.01)；醛固酮（1×10-7mol/L）+阿托伐他汀（1×10-6,1×10-5,1×10-4mol/L）组明显低于醛固酮（1×10-7mol/L）组，差异有统计学意义（P 0.01）；醛固酮（1×10-7mol/L）+阿托伐他汀（1×10-4mol/L）+甲羟戊酸（1×10-3mol/L）组明显高于醛固酮（1×10-7mol/L）+阿托伐他汀（1×10-4mol/L）组，差异有统计学意义(P 0.01)，但和醛固酮（1×10-7mol/L）组接近，差异无统计学意义(P 0.05).结论：阿托伐他汀可抑制醛固酮诱导的CFsppET1mRNA表达以及ET1的合成和分泌，其机制可能与甲羟戊酸代谢途径有关. 【关键词】醛固酮；内皮缩血管肽类；阿托伐他汀；心脏；成纤维细胞 0引言 他汀类药物是胆固醇合成限速酶的抑制剂，近年来大量资料提示，此类药物除有调脂作用外，还有非调脂作用，在减轻心脏重塑中发挥着重要的作用.我们以往的实验［1］发现心脏成纤维细胞（cardiacfibroblasts,CFs）可分泌内皮素（endothelin,ET），与心肌纤维化的发生、发展密切相关，推测阿托伐他汀有可能通过调节ET的表达参与了抗心肌纤维化过程.因此，本实验旨在观察阿托伐他汀对醛固酮诱导新生SD大鼠CFs内皮素1前体（preproendothelin1,ppET1）mRNA表达以及ET1的合成和分泌的影响. 1材料和方法 1.1材料 出生1～3d的SD大鼠15只（河北医科大学动物中心）.醛固酮、甲羟戊酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（Sigma公司）；DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；ET1多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；纤维连接蛋白mAb（SantaCruz公司）.RT试剂、PCR试剂和DNAMarker（大连TaKaRa公司）；内皮素放免试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）.阿托伐他汀（北京嘉林药业股份有限公司）. 1.2方法 1.2.1CFs的培养和鉴定 取1～3d龄SD大鼠在无菌条件下开胸剪取心室，用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得CFs［2］.在50mL/LCO2，37℃培养箱中孵育，待CFs生长接近融合时以1∶3传代，实验采用已传2～4代的CFs，SABC法免疫组织化学染色，纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的CFs. 1.2.2实验分组 将CFs(2×105细胞/cm2)接种于24孔培养板和25cm2的玻璃培养瓶中，待细胞生长至亚融合状态时，以10g/L牛血清白蛋白培养液培养预适应24h后，根据实验分组要求换用加入各种处理因素的10g/L牛血清白蛋白培养液继续培养.实验分组为正常对照组，醛固酮(1×10-7mol/L)组，醛固酮(1×10-7mol/L)+阿托伐他汀(1×10-6，1×10-5，1×10-4mol/L)组和醛固酮(1×10-7mol/L)+阿托伐他汀(1×10-4mol/L)+甲羟戊酸(1×10-3mol/L)组. 1.2.3CFs培养液中ET的水平应用放射免疫分析法，按照试剂盒说明书操作，测定CFs培养液中的ET水平. 1.2.4CFs中ET1的含量用胰蛋白酶EDTA消化、收集细胞，固定于4℃，700mL/L乙醇中.应用流式细胞术［3］，采用EpicsXLⅡ型流式细胞仪和Expo32ADC进行免疫荧光数据分析. 1.2.5CFsET1mRNA的表达 提取细胞总RNA，进行逆转录反应.PpET1引物［4］(上游5′AACCATGGATTATTTGCTCATG3′,下游5′AGTGTTGACCCAAATGATGTC3′)和GAPDH引物［5］(上游5′AATGCATCCTGCACCAA3′,下游5′GTAGCCATATTCATTGTCATA3′)由北京塞百盛基因技术有限公司合成，可扩增出长度为230bp的ppET1cDNA片段和515bp的GAPDHcDNA片段.PCR反应条件：ppET1：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸60s；GAPDH：94℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸90s，32个循环.PCR产物于含