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白藜芦醇的定量分析 作者：唐迪 赵婷 仰榴青 单位：江苏农林职业技术学院 江苏大学食品与生物工程学院 江苏大学化学化工学院 酿酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜芦醇标准品(中国药品生物制品检定所生产);甲醇为上海化学试剂有限公司生产，色谱纯;其他试剂均为市售分析纯。料处理酿酒葡萄渣在60℃的电热恒温鼓风干燥箱中烘24h，粉碎后过40目筛，置干燥器中备用。白藜芦醇的提取［13－15］精密称取30g酿酒葡萄渣原料，以80%乙醇作为提取溶剂，液料比为10mL∶1g，提取温度为60℃，共提取3次，每次提取时间为2h，第2、3次提取前各超声10min，合并3次所得滤液，在40℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得酿酒葡萄渣提取样品。 样品预净化处理(1)白藜芦醇的定性鉴定。白藜芦醇在365nm处显蓝紫色荧光。用薄层层析法检测，展开剂为三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)时，根据标准品Rf值=0．638定性鉴定白藜芦醇的存在，从而能有效控制预处理过程。点样:取活化好的硅胶GF254板，薄层板尺寸为:10cmtimes;20cm，距薄板一端约1．5cm处，用铅笔轻轻划1条与底边平行的直线，确定各样品点样位置。然后分别用毛细管吸取白藜芦醇标准溶液、酿酒葡萄渣溶液进行点样。样点之间的距离约1cm，薄层两边距离约1cm。展开:将点样好的薄层板置于展开剂中，上行展开15cm，取出，挥干溶剂。检测:在365nm紫外灯下观察荧光斑点。(2)样品预净化处理。准确吸取0．5mL提取样品，加样于硅胶柱上(硅胶10g，硅胶柱为10mmtimes;250mm的玻璃柱，湿法装柱)。用约35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)洗脱，依据上述方法跟踪鉴定，收集白藜芦醇组分，浓缩至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45mu;m滤膜过滤得样品溶液。平行处理3个样品，待HPLC测定。1．3．4白藜芦醇含量测定(1)检测波长的选择。以甲醇作为溶剂空白，在220～400nm处对白藜芦醇标准品溶液进行扫描，确定白藜芦醇的最大吸收波长。(2)HPLC色谱分析条件。色谱条件:色谱柱HypersilODS(4．6mmtimes;250mm，5mu;m);流动相－甲醇－水(体积比45∶55);流速0．8mL/min;柱温35℃;检测波长:306nm;色谱工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外标曲线的测定。准确称取白藜芦醇标准品，用甲醇－水(体积比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分别从中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分别定容至10mL，用0．45mu;m滤膜过滤，得浓度分别为1．65、3．3、4．95、6．6、8.25mu;g/mL的白藜芦醇标准溶液。在上述色谱条件下进样10mu;L，平行测定3次，求其峰面积的平均值，计算得外标曲线。(4)酿酒葡萄渣中白藜芦醇含量测定。将“1．3．3”预净化处理过的样品进样20mu;L，平行测定3次，计算白藜芦醇的峰面积，根据外标曲线求出白藜芦醇的含量。 检测波长的选择白藜芦醇的紫外吸收光谱图见图1。可见最大吸收波长为306nm，与前人研究结果一致，故本研究选择306nm为检测波长。 外标曲线的确定白藜芦醇标准品的HPLC图见图2。以对照品进样量(mu;g)x对峰面积积分值y进行线性回归，结果表明，白藜芦醇在0．0165～0．0825mu;g范围内线性关系良好，其线性方程为y=7times;106x－82231(r=0．9999)。 重现性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，平行5份，测定白藜芦醇的峰面积，其5次测定的RSD为4．8%，重现性好。 稳定性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，精密吸取同一样品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分别进样测定峰面积，RSD为1.2%(n=9)，可见样品在24h内基本稳定。 加样回收率试验加20mu;g白藜芦醇标准品于酿酒葡萄渣样品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法处理样品并进行HPLC测定，每个样品平行测定3次，求平均峰面积，根据外标曲线计算加样回收率。5次测定的白藜芦醇的回收率为94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率为98．9%，RSD为5.04%(n=5)。 酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量测定酿酒葡萄渣预处理样品的HPLC图谱见图3。经过一步硅胶柱预处理，不仅白藜芦醇得到了富集，且白藜芦醇峰与其他杂质峰得以完全分离，无杂质峰干扰，预处理净化效果好。试验测得河北酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量为6．482mu;g/g干葡萄渣，而新疆酿酒葡萄渣中未检测到