抗菌肽的基因工程表达研究进展.ppt

抗菌肽的基因工程表达研究进展 报告者：周忠凯 学号专业：水产养殖 抗菌肽简介 抗菌肽是一种由多种生物体分泌的、具有抗菌活性的一类多肽。 1980，Boman发现天蚕素(cecropin)。 1700余种抗菌肽陆续诞生。 抗菌肽的理化性质 ①相对分子质量小、水溶性好； ②热稳定性好； ③等电点一般都7； ④抗酸碱及抗离子强度的特性强； ⑤部分抗菌肽抗某些酶水解； ⑥C端往往是酰胺化； ⑦抗菌肽具有近乎完美的水脂两亲性； ⑧对病原有杀菌活性，而对正常的真核细胞无影响； ⑨多为半抗原，无免疫原性。 抗菌肽的来源 抗菌肽的基因工程表达 大肠杆菌表达体系 大肠杆菌具有遗传背景清楚、培养周期短、目的基因表达水平高、带有易于纯化的标签蛋白等,所以大肠杆菌成为最早被应用于表达抗菌肽的表达系统。 常用的载体系统：pGEx载体系统、pET载体系统、pTixFus载体系统、pMAL载体系统及IMPACT系统。 赵冬梅(2013)在E. coliBL21中重组表达斑点叉尾鮰的hepcidin抗菌肽基因,成功构建了pET32a-pCH 和 pET32a-mCH 两个重组表达质粒，获得了高纯度的目的蛋白 mCH，当 mCH 的浓度为 10μg/mL 时，在金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的平板上均观察到明显的抑菌圈。 虽然原核表达体系具有诸多优点,但与此同时,原核表达系统还存在许多缺点: ①表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控; ②持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用; ③过量表达可能导致非生理反应; ④包涵体形式表达的目的蛋白难以纯化; ⑤翻译后加工修饰体系不完善; ⑥表达产物的生物活性较低。 酵母菌表达体系 酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制及对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。 近年来应用最为广泛的是毕赤酵母，毕赤酵母有如下优势: ①有多种可以利用的强启动子; ②表达水平高，胞内表达和分泌表达； ③发酵工艺适合大规模工业化生产； ④培养成本低； ⑤外源基因遗传稳定。 赵冬梅(2013)运用毕赤酵母表达系统表达重组表达斑点叉尾鮰的hepcidin抗菌肽基因,该基因装载于 pGAPZα A-mCH-mTH载体,转染毕赤酵母工程菌，获得高纯度的目的蛋白。 综合所述与原核表达系统相比其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达,为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达,既可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。 存在的问题和前景展望 需要解决的问题： ①来源的问题：是否能表达及表达量多少； ②生物活性问题：空间结构上的变化； ③安全性问题：药理、药动、药代及毒理方面。 前景展望 抗菌肽非常重要的特点是不产生耐药性。抗菌肽的制备一直是抗菌肽研究与应用的瓶颈，通过基因工程技术制备抗菌肽又成为解决这一难题的有效途径。相信在不久的将来，抗菌肽必将极大地造福于人类。 * * 目录 抗菌肽的简介和理化性质 1 抗菌肽的生物学活性 2 抗菌肽的作用机制 3 抗菌肽的基因工程表达 4 华桑抗菌肽活性收缩水100mL 杭州露滋兰生物科技有限公司 功效： 调整皮肤 的酸碱度 平衡油脂 杀菌消炎 收缩毛孔 防止皮肤 皱纹和暗 疮的产生 抗菌肽对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞以及寄生虫都具有细胞毒性，在生物免疫调节系统中也起着重要的作用。 抗菌肽的生物学活性 抗病毒活性 α-防御素结合疱疹病毒， Melitiins抑制HIV的复制； 抗细菌、真菌活性 Andropin杀革兰氏阳性菌，Apodaecin杀革兰氏阴性菌，Drosomycin杀真菌； 免疫系统调节 Defensins可以增强细胞的趋化性以及细胞因子的产生。 抗肿瘤活性 Magainins溶解造血肿瘤细胞， Temporin L诱导肿瘤细胞坏死； 抗菌肽的生物学活性 抗菌肽的作用机制 1 细胞膜渗透作用 肽的疏水部分和亲水部分分别与胞膜磷脂的疏水头基和胞膜脂质结合，形成跨膜的通道，内容物大量外流、水分大量内流，渗透压不能保持正常而死亡。 作用于胞内不同靶点 抗菌肽与细胞膜相互作用形成跨膜通道后，抗菌肽可以大量进入细胞质与不同的靶点结合，进而发挥其生物学功能。靶点有：细胞壁、细胞膜、线粒体、蛋白质、核苷酸。 抗菌肽可通过 以下3种途径 获得 从生物体内直 接提取纯化 化学方法 人工合成 基因工程进 行抗菌肽人 工表达 进行抗菌肽研究的两种表达体系 原核表达体系 中大肠杆菌表 达体系最具代 表性 真核表达体系有小球藻 表达体系、杆状病毒介 导的昆虫表达系统、 酵母表达体系,其中酵 母表达体系用