甲胎蛋白检测实验试卷.pptx

临五1507 吴冠桦;;1.判断该方法检测甲胎蛋白的难易程度。 2.实验该方法是否便于作为临床检测甲胎蛋白使用。 ;实验原理;;;;技术流程;实验步骤;(一)蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳;（1）将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板 顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层 （2）待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合 ，大约30min完成聚合。倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端 ，插上样品梳，放置待其聚合。;30％丙烯酰胺贮备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。 分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。 10％过硫酸铵：临用前用蒸馏水配制。 10％SDS 10％TEMED 封闭液及抗体稀释液：5％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。 ???物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10μl H2O2，临用前配制。 ;(二)蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体;2.配制电极缓冲液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每组配1000ml。 3.制 样：5μl人血清，加45μl水，再加50μl加样缓冲液。沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。 4.加 样： （1）加入电极缓冲液，拔出胶的样品梳； （2）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5μl分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10μl人血清样品。 5.电泳 稳压120V/200V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。;(二)蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体;(三)对固定于硝酸纤维素滤膜上的甲胎蛋白进行染色;辣根过氧化物酶最敏感的底物是3,3‘-二氨基联苯胺，它在过氧化物酶所在部位转变成棕色沉淀。在钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。但是，使用辣根过氧化物酶不可能完全排除背景颜色，因此须十分小心地观察生色反应，一旦特异性染色蛋白带清晰可见，就应尽快终止生色反应。;（四）化学发光、显影、定影;结果与分析;