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双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验 浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台 机型:Zeiss LSM710 nlo 32通道阵列PMT 690-1080nm可调谐飞秒激光器 激光共聚焦显微镜的非常规应用 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源 GFP标记水稻根中自发荧光的清除 单光子激发,水稻根带有强烈的黄绿色自发荧光 双光子激发,自发荧光为蓝色 ex 488nm,Lambda mode ex 820nm , lambda mode GFP标记水稻根中自发荧光的清除 双光子激发下GFP荧光与自发荧光的波长分离,820nm激发时,仅采集493-542nm区间的信号以保证特异性 Ex 820nm, channel mode 微弱或自发荧光存在下的信号鉴定 Promoter::GFP载体注射烟草叶片(lambda mode成像) 转GFP弱表达 转GFP不表达 镜下目视特征: 绿色信号被强烈红光掩盖 GFP和RFP弱时无法分辨 Lambda合成图特征: GFP:绿色偏蓝 自发荧光:绿色偏黄 叶绿素荧光:红色 光谱特征: GFP: 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 自发荧光: 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光: 625nm以上强烈信号 GFP 叶绿素 转基因材料的快速筛选 原则:密集预排列待测样 技巧:lambda扫描 色彩判别 荧光峰形检查 GFP蓝绿特征色 GFP台阶形特征峰 518 540 土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析 目的:了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法:等比掺入外源GFP标记菌体,设置多种环境条件 问题:土壤标本背景嘈杂,往往带有各种带荧光的杂质颗粒 解决: 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole 非线性效应:碳纳米管 498 518 421 原理:某些材料在双光子激发,会发射波长为激发光一半的荧光 利用不同波长的双光子激光照射可能含碳纳米管的靶向药物,lambda扫描发现荧光信号呈现严格的倍频关系 Ex 850 Ex 1000 Ex 1040 光刻和深度扫描 一种人工合成的透明有机晶体,在一定强度的近紫外光下会发生局部变性,从而具有双光子效应 在2个不同Z坐标下做bleach, ex 458nm ex 900nm 做z-stack,显示多层光刻效果,信号随深度增加而衰减 叶表面蜡质层成像及厚度测定 菲(多环芳烃类)渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack 谢谢大家
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