双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验.ppt

双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验 浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台 机型：Zeiss LSM710 nlo 32通道阵列PMT 690-1080nm可调谐飞秒激光器 激光共聚焦显微镜的非常规应用 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源 GFP标记水稻根中自发荧光的清除 单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色自发荧光 双光子激发，自发荧光为蓝色 ex 488nm，Lambda mode ex 820nm , lambda mode GFP标记水稻根中自发荧光的清除 双光子激发下GFP荧光与自发荧光的波长分离，820nm激发时，仅采集493-542nm区间的信号以保证特异性 Ex 820nm, channel mode 微弱或自发荧光存在下的信号鉴定 Promoter::GFP载体注射烟草叶片（lambda mode成像） 转GFP弱表达 转GFP不表达 镜下目视特征： 绿色信号被强烈红光掩盖 GFP和RFP弱时无法分辨 Lambda合成图特征： GFP：绿色偏蓝 自发荧光：绿色偏黄 叶绿素荧光：红色 光谱特征： GFP： 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 自发荧光： 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光： 625nm以上强烈信号 GFP 叶绿素 转基因材料的快速筛选 原则：密集预排列待测样 技巧：lambda扫描 色彩判别 荧光峰形检查 GFP蓝绿特征色 GFP台阶形特征峰 518 540 土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析 目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole 非线性效应：碳纳米管 498 518 421 原理：某些材料在双光子激发，会发射波长为激发光一半的荧光 利用不同波长的双光子激光照射可能含碳纳米管的靶向药物，lambda扫描发现荧光信号呈现严格的倍频关系 Ex 850 Ex 1000 Ex 1040 光刻和深度扫描 一种人工合成的透明有机晶体，在一定强度的近紫外光下会发生局部变性，从而具有双光子效应 在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm ex 900nm 做z-stack，显示多层光刻效果，信号随深度增加而衰减 叶表面蜡质层成像及厚度测定 菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack 谢谢大家