副猪嗜血杆菌对猪气管上皮细胞黏附作用的探究.pdfVIP

细菌病一副猪嗜血杆菌病 副猪嗜血杆菌对猪气管上皮细胞黏附作用的研究 王津津张彦明2汤智慧唐青海全刚 (西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100) 摘要为了探讨副猪嗜血杆菌(Haemophilusp撇suis，Hps)与原代培养的猪气管上皮细胞的黏附作用，应用气管支 气管结扎灌注酶冷消化法分离气管黏膜上皮细胞，胶原覆盖的盖玻片上培养，使上皮细胞分化成假复层黏膜纤毛上 皮细胞，然后用对数生长期的Hps以不同浓度感染上皮细胞和猪脐静脉血管内皮细胞，分别作用lh、2h．3h，4h 后，通过革兰氏染色法观察Hps对细胞的黏附情况。结果表明，Hps可黏附在上皮细胞和内皮细胞表面；Hps对气 管上皮细胞有毒性作用，致细胞变性坏死和凋亡；Hps对细胞的黏附力和菌液浓度和作用时间有关系，浓度为1．O×108 cfIl／mL Hps感染4h后，黏附效果最好。高倍显微镜下可见大量Hps黏附于猪气管上皮细胞，只有个别Hps黏附于 猪血管内皮细胞表面。说明Hps对猪气管上皮细胞的黏附能力远强于猪血管内皮细胞，可以利用猪气管上皮细胞建 立副猪嗜血杆菌的黏附细胞模型。 关键词 副猪嗜血杆菌；猪气管黏膜上皮细胞；黏附作用 副猪嗜血杆菌他踟D砌f伽阳船“妇．Hps)足一种NAD依赖犁、不运动的革兰氏阴性细小杆菌， 菌群，在猪格氏病的致病过程中的作用尚不完伞清楚，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等感 染造成的免疫抑制可能加剧本菌的感染，本菌常与猪流感病毒联合感染引起猪流感【I】。Hps常引起 猪的多发性浆膜炎、关{了炎以及脑膜炎，称为猪格氏病(Glsser’sdisease)，对养猪业生产造成的 损失很大【2J。近年来，困外学者利用多种猪的细胞株模掣【j制，对Hps的致病机制进行了有意义的探 索，但国内尚无相关报道。我们利用原代培养的猪气管黏膜上皮细胞和永生化的猪脐静脉血管内皮 细胞，对HDs对猪气管黏膜L皮细胞的黏附作用进行了初步研究，建立了副猪嗜血杆菌对猪气管黏 膜上皮细胞的黏附模掣。 l材料和方法 1．1材料 1．1．1动物和组织来源 刚出生的未哺乳健康长F1仔猪(杨凌光明种猪场提供)，心脏采血致死，无菌条件F取出气管(包 筚肺I’J)，放十冰冷的PBS中，剔除气管周围的软骨组织，用含有青霉素10万IU／L、链霉素50 m玑 的冰冷PBS反复冲洗气管内外，PBS浸泡待用。 1．1．2菌株、细胞株和试剂 参考菌株副猪嗜血杆菌(，砌Pm叩^f胁sp口加s材弛Hps)由安徽农业大学动物科技学院李郁副教授 馈赠；标准菌株金黄色葡萄球菌(CVCC2258)，购自中国兽药监察所菌种保藏中心；永生化猪 脐静脉血管内皮细胞，由两北农林科技人学颁防兽医学实验室建立和保存；链酶蛋白酶XⅣ型、入 DMEM／F12培养基、L．谷 表皮生长冈子(EGF)、甲状腺素(T3)、胰岛素．转铁因子．硒补充剂(ITS)、 品；小鼠抗人角蚩白8／18型单克隆抗体为卜海长岛牛物产品：FITC标记羊抗鼠IgG为武汉博上德 公司产品；辅酶I(NAD)为西安沃尔森牛物公司产品。 1．1．3主要仪器 基金项目：陕西省重大科技攻关项目(2006Icz07．G2)资助。 作者简介：王津津(1984_一)，男，陕西渭南人，硕士，主要从事分子病原学与免疫学研究。 E．mail：w5213012@163．com 通信作者：张彦明(195仁)，男，陕西南郑人，博士，教授，博士生导师，主要从事分子病原学与免疫学研究。 电话：209E-Illail：zhangym@nwsuaf’．edu．cn 542 第四次猪病学术研讨会会议论文集 滤器、倒置显微镜、荧光显微镜州ⅨON)、生化培养箱。 1．2方法 1．2．1细胞培养液配制 EGF、100删mL 在DMEM／F12中加入10鹇，mLITS、l蚴。儿谷氨酰胺、20n∥mLT3、20Il∥mL IU／mL两性霉素B、10IU佃