简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鉴定.pdfVIP

简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆厦表达与初步鉴定 中文摘要 ● 简化的人纤溶酶原饼环区5基因 的克隆及表达与初步鉴定 研究生 王健琪 导师 翟朝阳 教授 背景与目的 血管发生存在于许多病理演变过程中，如增殖性视网膜病 变、心血管病(动脉粥样硬化)、以及肿瘤的生长、浸润和转移等环节。 ● 血管发生是一个复杂的、由激活因子与抑制因子共同调控的过程。目前， 在所报道的内源性抑制因子中，血管抑素是最强的血管发生的负向调节 因子之一，它是人纤溶酶原的内源片段，由纤溶酶原的五个Kringle环中 的前四个构成，在体内外的肿瘤模型试验均已证实了血管抑素能够有效 的抑制肿瘤生长。最近研究发现，与血管抑素由一个赖氨酸相连的人纤 溶酶原的第五个rJingle环，即人纤溶酶原Kringle5(Human plasminogen 5,hPK-5)，它的抗内皮细胞迁移能力更强，能够更有效的抑制由 kringle 生长因子诱导的新生血管增殖，并能诱导部分肿瘤细胞凋亡。分子遗传 学研究表明，人纤溶酶原内部的这5个rai．gic环的蛋白质一级结构有 50％左右的同源性。然而它们表现的生物学活性各不相同。完整的 ◆ 细胞增殖作用较弱，而Kringle5区抑制内皮细胞增殖和抗迁移能力都较 强。这使得Kringle5的应用价值更为突出。目前，hPK．5主要是通过基 因工程重组技术获得，其纯化复杂，且得率较低，而且hPK-5的相对分 简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鉴定 子量仍偏大。因此，我们通过研究hPK-5的功能性区域及蛋白的空间结 ● 构，删除了hPK．5的核苷酸序列的N端和c端各部分残基，保留了环状 hPK．5，predhPK．5)，并将其与GST进行融和表达。 方法从肝癌患者术后的癌旁组织中提取总RNA，经过合理设计引物， 利用RT-PCR直接得到简化的hPK．5基因。将该基因克隆至原核表达质 切鉴定及测序鉴定阳性克隆。用IPTG诱导阳性克隆表达融合蛋白， 步鉴定融合表达蛋白。 序等方法鉴定简化的hPK-5基因正确克隆至原核表达质粒pGEx．ILl中。 104， GST／predhPK．5融合蛋白，并通过免疫学测定，相对分子质量约为3．6X 与理论值3．58×104相符。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的23．6％。 结论成功克隆出来简化的hPK．5基因并且表达了简化的hPK-5蛋白， 为进一步探讨hPK-5的抗血管增殖活性以及研究其作用机制奠定了基础。 关键词；简化的hPK-5 kirngle环基因重组融合表达 ◆ 2 简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及表达与初步鉴定 abstract English ●