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三、电泳法（electrophoresis） 历史及应用 分类（据原理） 基本原理 常用电泳法例举 [全属于区带电泳（注意介质）] 电泳法最早由瑞典的Tiselius于1937建立，用移界电泳法成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即白蛋白、α1 - 、α2 - 、β-、和γ-球蛋白。 在药学领域，是生化药物和基因工程药物分析的重要手段。 按分离原理分类 移界电泳 （moving boundary EP） 区带电泳 (zone EP) 等速电泳 (isotachophoresis) 等电聚焦 (isoelectricfocusing) 高效毛细管电泳（high performance capillary electrophores,HPCE） 离子强度对电泳的影响 离子强度 电渗现象对电泳的影响 醋酸纤维素较纸电泳的优点 电渗现象影响小 醋酸纤维素膜对蛋白的吸附小，几无“拖尾”。 由于醋酸纤维素亲水性小，所容纳的缓冲液也较少，电流大部分是由样品传导，所以分离速度快。 SDS与PAGE有什么区别呢？ 琼脂 四、生物检定法 生物检定的应用范围 药物效价测定 1.理化方法不能测定含量 2. 虽可用理化方法测定，但理化测定不能反映临床生物活性 或效价（如氨基苷类） 微量生理活性物质的测定 因浓度低，很难用理化方法测定（神经介质、激素等） * * 不同电泳法的分离原理示意图 AB + B A B A AB B A ABC C B A 移界 区带 A B C 等速 等电聚焦 pH 9 8 7 6 混合 分立 稳态 时毗邻 稳态 时分立静止 毛细管区带电泳 毛细管等电聚焦 …… 与一般电泳法的区别： 使用了毛细管柱。 极为高效。 基本原理： 在电场作用下,溶质因 迁移率(泳动率)不同而达到分离. 阻力: f=6пrηv (r为质点直径; η为介质粘度;v为迁移率) 受力分析 动力: F=EQ 质荷比 质点有效直径 溶液粘度 离子强度 电渗现象 影响因素 离子氛现象：被分离的粒子（如蛋白），在离子 强度大的体系中。离子氛现象明显。具相反电 荷的粒子阻碍了粒子的运动, 朝相反方向运动. + + + + + + + + + 离子氛 迁移率 电渗：液体在电场中对固体支持物的相对移动 固体 - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + 电渗方向 特点 原理 介质 分辨率低 质荷比 纸（纤维素） 纸电泳 Paper electrophoresis 因孔径大，用于核酸的研究 分子筛 琼脂糖 琼脂糖凝胶电泳 用于测定蛋白质亚基的分子量 分子筛 聚丙烯酰胺凝胶 SDS凝胶不仅作为支持物，且以分子筛主动参与样品的分离。 质荷比+分子筛 聚丙烯酰胺凝胶 PAGE法 在纸电泳基础上的改进 质荷比 醋酸纤维素 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是纤维素（纸）的醋酸酯 丙烯酰胺 + N，N-甲叉双丙烯酰胺 具三维空间凝胶网络 聚合 催化剂：过硫酸铵（AP）催化生成自由基 加速剂： 四甲基乙二胺（TEMED）提供自由基 为什么聚丙烯酰胺具有分子筛的作用？ （不同的配比 不同的孔径） SDS（十二烷基磺酸钠）+蛋白 线性复合物 使复合物所带负电荷远超过天然蛋白本身电荷，消除了电荷效应，而分子量占主导。 琼脂糖 琼脂胶 脱去SO42-丙酮酸酯基 应用 由于孔径大，对大多数蛋白来说，其分子筛作用微不足道。 因此广泛应用于核酸的研究，分离范围广（200bp-50kb的DNA）. PAGE 圆盘电泳（disc EP）不连续 平板电泳（slab EP）连续 样品胶 （溶解样品） 浓缩胶 （无分子筛作用，浓缩样品） 分离胶 （主要分子筛兼有质荷比） disc Notice: 1.两化合物均是中枢神经系统毒物,避免吸入粉尘和接触皮肤。 2.染色： 一般用考马斯亮蓝R-250（595nm） 若灵敏度要求高，用微量银染（灵敏度较前者大100倍） Steps: 1.制胶 2.上样 3.电泳 4.染色 Steps