第二附属中学高二生物《单克隆抗体的制备》孙晓红ppt.ppt

免疫的过程 * * * * * * * * 一、动物细胞融合（细胞杂交） 1、概念： 指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。 2、结果： 形成单核的杂交细胞 3、原理： 细胞膜的流动性 4、诱导方法 物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活的病毒 不同DNA的两个细胞 灭活病毒诱导细胞融合 融合后的细胞进行有丝分裂 5、动物细胞融合过程 筛选杂交细胞 6、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。 7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。 特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体 二、单克隆抗体（monoclonal antibody , McAb） 什么是抗体？ 机体受抗原刺激后，效应B淋巴细胞产生的，能与抗原发生特异性结合的具有免疫功能的免疫球蛋白（Ig)。 主要分布在血清中 抗原 B淋巴细胞 抗体 记忆B细胞 抗 原 刺激 产生 一部分造血干细胞在骨髓分化成B淋巴细胞，部分转移至淋巴器官中 增殖分化 效应B细胞 结合 每一种效应B细胞只能产生一种抗体 传统的获得抗体的方法是什么？ 方法：注射抗原，血清分离 传统方法的缺点是什么？ 缺点：产量低、纯度低、特异性差 想获得单一抗体的方法是什么？ 要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群 这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体 体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？ 1975，米尔斯坦和柯勒 杂交瘤技术 骨髓瘤细胞 杂交 筛选 1、设计方案： 一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖 杂种细胞 根据米尔斯坦和柯勒设计的 实验方案: 2、制备过程： 诱导其融合的方法有哪些？ 融合后培养液中有几种细胞 怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点 注射抗原的目的是什么？ 为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选 大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法 HAT选择培养原理 核苷酸从头合成途径（de novo synthesis） 核苷酸补救合成途径（salvage synthesis） HAT 核苷酸 DNA 氨基碟呤（A） 次黄嘌呤（H） 胸腺嘧啶核苷（T） 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT) 瘤细胞是HGPRT酶缺陷细胞，自身不能通过补救途径合成DNA而繁殖。 B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降)。 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。 有限稀释法 计数 103/ml 102/ml 10/ml 1个细胞 / 孔