一种分离纯化透明质酸的新型离子交换剂-华熙福瑞达生物医药有限公司.PDF

一种分离纯化透明质酸的新型离子交换剂 李润 倪杭生 罗敏 贺艳丽 透明质酸(hyaluronic acid,1)是一种酸性黏多糖，其大分子结构、高黏度和高 [1] 保湿的特性，使它在生命有机体中具有润滑、保水等多种功能 。其用于眼科手 术时无抗原性、无致炎性和无异物反应，是现代眼科手术不可缺少的理想辅助剂。 因此，对1 的制备与分离纯化的研究具有重要的实际意义。 医用 的1 要求高纯度，并具有大分子量。但无论从动物组织还是菌种发酵 液中提取的1 粗品都含有蛋白质、核酸等杂质。通常采用化学方法加以分离纯化， 但在纯化过程中pH 、酶、光、热和还原剂等因素易导致糖苷键的水解或分子间 解聚，使黏度发生不可逆的下降。由于离子交换色谱基于被分离组分与交换剂之 间存在的静电作用，在生物大分子分离与纯化中具有化学方法不可比拟的优越 性。本文根据1 与蛋白质、核酸在结构和性质上的差别，以及它们与离子交换剂 [2,3] 的作用原理 ，以含多个氮原子的组氨酸修饰强碱型阴离子树脂，制得可纯化1 粗品的新型离子交换剂——组氨酸-强碱型阴离子树脂，用于1 粗品的层析分离， 取得了良好的分离效果。 1 剂与仪器 1 粗品和1 对 品( 山东正大福瑞达制药有限公司) ；强碱型阴离子树脂(南开 大学有机化工厂) ；牛血清白蛋白对 品、组氨酸(生化试剂) ；氯磺酸、四硼酸钠 为分析纯。 紫外检测仪(Hitachi Instruments Inc.)；蠕动泵(东方科学仪器厂) ；自动部分收 集器(上海东风电讯仪器厂) 。 2 方法与结果 2.1 强碱型阴离子树脂的修饰 2.1.1 -SO Cl 基团引入 2 装有温度计、搅拌器和回流冷凝装置(接尾气吸收装置) 的250ml 三口烧瓶中 加入氯磺酸(75ml)和强碱型阴离子树脂(40g) ，水浴升温至 80℃，反应9h。反应 过程中，搅拌速度和反应温度保持不变。将产物缓缓倾入另一装有 1000ml 冰冻 PDF created with pdfFactory trial version 的去离子水、并装有搅拌器的1500ml 三口烧瓶中，洗涤至中性，抽滤、晾干， 得氯磺化树脂。 2.1.2 氨基酸基团的引入 晾干后的树脂置于 250ml 的烧杯中，加入去离子水(100ml) ，用四硼酸钠 (Na B O ·10H O)调溶液pH 值至9.8，转入装有温度计和搅拌器的250ml 三口 2 4 7 2 烧瓶中，加入组氨酸(10g)，水浴控制反应温度为 18℃，连续搅拌 22h 。反应结 束，用去离子水冲洗5～6 次，抽滤、晾干，得组氨酸-强碱性阴离子树脂。 2.2 修饰的检验 2.2.1 氨基酸的特征显色反应 取少许 修饰的树脂小球，用去离子水反复洗涤后，抽干，置于小烧杯中。 再加适量去离子水，滴加 0.1%的茚三酮乙醇溶液，烧杯内不显紫色。将树脂小 球取出，置于2.5mol/L 的氢氧化钠溶液中，加热水解，然后加入2mol/L 盐酸溶 液，调pH 值至中性。滴加0.1%的茚三酮乙醇溶液，加热，溶液显紫色。这是游 离氨基酸与茚三酮的特征反应，表明修饰后的树脂已带有组