凯氏法蛋白质测定.pptVIP

第十一讲 食品蛋白质及氨基酸的测定 1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。 测定蛋白质最基本的方法是通过先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中的蛋白质含量。 食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量和杜马法。 这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。 一些蛋白质的含氮量 一般为 15%~ 17.6%，有的上下浮动可以测出总氮 N 2.蛋白质定量法 一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。 1.原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化(digest)，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。 而样品中的有机氮(organic nitrogen)转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。 然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 （1）消化 总反应式： 2 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。 3 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。 （2）蒸馏 消化完全的样品溶液，浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气 (NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O (3）吸收与滴定(titration) 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 也可采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从而计算总氮量 2、适用范围（application) 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。 3、试剂 浓硫酸：脱水、氧化 硫酸铜：催化剂及消化指示剂 硫酸钾：提高溶液的沸点 氢氧化钠 混合指示剂 硼酸 盐酸 4、操作方法 （1）消化：固体样品0.2-2g，半固体样品2-5g，液体样品10-20ml，加入催化剂及浓硫酸进行消化至溶液绿色透明。（同时做空白实验） （2）蒸馏： 按装置进行连接，奈氏试剂检查，无红棕色物质生成(检查氨是否全部蒸完)，蒸馏过程中用硼酸吸收。 （3）滴定用0.1000mol/L盐酸滴定至由兰色变为微红色。（甲基红为指示剂） 5.蛋白质计算 (V1－V0) ×C×0.014×F×100 蛋白质=—————————————————— m×n V1－V0——滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数； C——标准盐酸溶液的当量浓度； 0.14——1毫升当量氮的克数； F——氮的蛋白质换算系数； m——样品克数。 n ——稀释倍数 6.注意事项 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。 在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。 二、 微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置 三、 自动凯氏定氮法 四、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 都是快速测定蛋白质的方法 1、原理 当脲（尿素NH2—CO—NH2）加热至150～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下： 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应 蛋白质分子含有肽键, 与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合