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及义c—myc雉埘转染抑制后发性白内障的实验研究 2004孙洁博士论文 反义c-myc基因转染抑制后发性白内障的实验研究 本课题受山东省白然科学基金资助(Y2003C04) 摘要 目的 后发性白内障(简称后发障)是白内障摘除术后影响视力的最主要并发症之一， 虽经多年不懈努力研究，至今尚未解决。术后2～5年成人发生率高达50％，儿童更 是高达100％。目前尚无有效的药物进行防治。因此，研究如何减少居发性白氏障的 发生，提高患者术后视力，具有重要的临床意义。 多年来，人们在不断改良人工晶状体的设计和手术技术的同时，还尝试了药物、 激光、手术等多种治疗手段，但对儿童白内障和并发性白内障的效果均无法令人满 意。基因治疗近年来在多种难治性疾病的防治方面取得了很大的发展，显示出其优 越的先进性和较为令人满意的效果。目前，已有大量的体外实验显示，反义基因疗 法可以抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的发生。反义c—myc基因转染对人视网膜色素 上皮细胞、乳腺癌细胞、淋巴瘤细胞、肝癌细胞等的增殖均有良好的抑制作用。基 于反义c—myc基因治疗抑制上述细胞增殖研究的成功经验，我们认为通过转基因技 术调控细胞周期，改变细胞增殖活性，很可能是一种极有前景的防治后发性自内障 的途径。 本研究通过体外、体内实验，利用转基因技术在国内外第一次将反义c—mvc基 因转染晶状体上皮细胞，观察其对晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响，从细胞周期 的改变、mRNA和蛋白质水平的变化等方面探讨其抑制后发性白内障发生的作用。 反义c—myc基圳转染抑制后发作[J内障的实验研究 2004孙清博J‘论文 材料和方法 一、体外实验 1 293细胞及永生化人品状体上皮细胞(HLEC)的培养 3．重组腺病毒转染效率的测定 48h后进行X-Gal染色。显微镜下观察，计算蓝染细胞占所有细胞的百分率，即为 转染效率。 4．Ad—AS．myc转染对HLEC影响的检测 (1)细胞形态学改变 将Ad—AS-myc按MOI 100感染HLEC，于感染后每日观察并记录细胞的形态变 化，并与正常HLEC进行比较。 (2)细胞生长曲线的变化 以5x 103个细胞／孔接种HLEC至6孔板，培养过夜。按MOI 100将Ad．AS．myc 转染细胞。定期(转染后24、48、72、96h)消化收集细胞，计算细胞密度。将实 验结果与对照组进行比较。 (3)MTT比色法分析细胞增殖的变化 以103个细胞／孔接种HLEC至96孔板，培养过夜。按MOI 100将Ad—AS-myc 加入DMSO，振荡，在酶联免疫测定仪上检测其在492nm处的吸光值。将实验结果 与对照组进行比较。 (4)流式细胞仪的检测 1)细胞凋亡的测定(Annexin．VKit法)：按M01 48、96h后采用Armexin—V 照组进行比较。 2)细胞周期分析：按MOI DNA倍体检测，MultiCycle软件分析结果。将实验结果与对照组进行比较。 (5)RT-PCR检测c-mycmRNA的表达 反义c．myc基㈨转染抑制后发性由内障的实验研究 2004孙洁博i论文 按MOI 分光光度计定量后进行逆转录，逆转录产物进行PCR，tubulin为内对照。琼脂糖凝 胶电泳分离PCR产物，紫外灯下观察。图像分析系统分析底片的灰度。将实验结果 与对照组进行比较。 (6)免疫组织化学法分析c．myc蛋白质的表达 按MOI 与对照组进行比较。 (7)Western Blotting分析c—myc蛋白质的表达 按MOI 膜上，按ECL蛋白分析试剂盒方法杂交。图像分析系统分析底片的灰度。将实验结 果与对照组进行比较。 二、体内实