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20162017学年高中生物第6章蛋白质和DNA技术第2节DNA片段的扩增PCR技术教案
第二节 DNA片段的扩增——PCR技术
一、DNA在细胞内的复制
1.所需的酶:解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。
2.引物:一段RNA。
3.原料:四种脱氧核苷酸。
4.原则:碱基互补配对原则。
二、PCR技术的过程
1.把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2+等成分加入到微量离心管中。
2.把离心管置于95℃的高温中,使DNA碱基对之间的氢键断裂,DNA双链拆开成为两条单链。
3.将离心管置于55℃的环境中,使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。
4.再将离心管转置于72℃的环境中,在DNA聚合酶的催化下,游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接,从而形成两条新的子链。这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。
三、实验操作
1.准备
(1)为了避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(2)如果没有PCR仪,可以设置3个恒温水浴锅,温度分别为95℃、55℃和72℃,然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。
2.扩增
3.检测
利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。即:DNA的浓度(μg/mL)=×稀释倍数。
预习完成后,请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中
问题1 问题2 问题3 问题4
一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外) 体内复制 PCR反应 不同点 解旋 在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分解开 加热至95 ℃左右,双链全部解开,不需解旋酶 引物 一小段RNA 单链DNA分子片段 合成子链 在引物基础上,一条链连续合成,另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始,都是连续合成,控制温度72 ℃ 特点 边解旋边复制,半保留复制 体外迅速扩增 TaqDNA聚合酶 不需要 需要 循环次数 受生物体自身控制 30多次 温度 体内温和条件 高温(可变) 相同点 ①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料
③都需要一定的缓冲溶液
④子链延伸的方向都是从5′端到3′端
①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。
②DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上,需要模板,而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。
二、PCR技术的实验操作程序
1.PCR扩增前的准备
移液
准备三个水浴锅
2.PCR扩增循环
预变性时间延长
最后一次延伸时间延长
3.检测PCR扩增效果
(1)稀释
4.绘图(DNA的紫外线吸收曲线图)
PCR技术的原理及过程 如图为某一次循环的产物,请 据图回答问题。
(1)PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可分为________、________、________三个步骤。
(2)PCR技术与细胞内DNA复制在解旋时原理不同:细胞内复制利用________使双链间氢键断裂,而PCR技术利用________原理,使双链氢键断裂。以引物为标识,可判断出此产物最早为第________次循环的产物。
(3)PCR反应中,如果以引物为标识,共有几种DNA分子产生?你能把它们画出来吗?
【审题导析】
【精讲精析】 (1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步,从第二轮循环开始,每次循环的产物也作为模板参与反应。
(2)DNA分子在细胞内复制时。在解旋酶的作用下使氢键断裂,而在体外,DNA在95 ℃的高温中变性。即双螺旋解开,成为单链;当温度慢慢降低后,两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。在PCR反应中,以引物为标记,第一次循环时,以加入的DNA为模板,两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的每个子DNA中只有一种引物;从第二次循环开始,上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应,所以会出现DNA分子两端均含引物的情况,如图所示:
因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。
(3)产生的DNA分子有3种:只含引物Ⅰ的,只含引物Ⅱ的和既含引物Ⅰ也含引物Ⅱ的。
【答案】 (1)高温变性 低温复性 中温延伸
(2)解旋酶 热变性 一
(3)共有3种,分别为:
当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50 ℃左右时,引物与模板结合,一般不考虑解开的两个DNA模板链的重新结合,原因:a.模板DNA比引物长得多而且复杂的多,不易重新结合;b.引物与模板间的碰撞机会远远多于模板互补链间的碰撞;c.加入的引物量足够大而模板链数量少。
PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下,合成许许多多相同片段的一种方法,利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片
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